微卫星（Microsatellite，MS）是指人类基因组中的短串联重复序列（Short tandem repeat，STR），包括单核苷酸的重复、双核苷酸的重复，甚至更多核苷酸的重复。微卫星不稳定（Microsatellite instability，MSI）是指相对于正常组织，肿瘤组织的微卫星由于重复单元的插入或缺失而造成微卫星任意长度的改变。

MSI的发现要追溯至1993年，Aaltonen et al.在Science上报道该团队发现遗传性非息肉病（Hereditary non-polyposis colorectal cancer，HNPCC）中MSI的发生率高达86%，而散发性结直肠癌MSI的发生率为16%。同一期的该期刊中，Thibodeau et al.也发现28%结直肠癌患者的肿瘤中发生了MSI的现象，同时发现MSI多发于近端结肠且与患者生存期延长呈显著相关。这些发现开启了肿瘤生物学和癌症易感性患者临床管理的新篇章。

MSI是错配修复系统（Mismatch repair，MMR）蛋白功能异常所导致的。在微卫星区域中，DNA复制时聚合酶在这些高度重复序列上容易滑脱，导致DNA合成出现错误。正常细胞中MMR系统可以识别并修复这些错误，而肿瘤细胞中MMR系统功能出现异常，无法识别和修复DNA在复制过程中产生的错误，因此DNA中的错误加速累积进而导致MSI的现象（图 1）。同时，研究中发现MSI的现象不仅仅存在于结直肠癌中，而是广泛的存在于多种肿瘤中，如子宫内膜癌、胃癌等。

图 1

目前检测MSI的金标准是PCR+毛细管电泳法，通常是用PCR方法同时对待测的肿瘤组织和正常组织的微卫星位点进行扩增，再通过毛细管电泳对扩增产物进行DNA片段分析。比较肿瘤组织和正常组织的基因图谱，如果肿瘤组织的五指峰相较于正常组织的五指峰发生了位移，则该微卫星位点不稳定。

20世纪90年代初，随着MSI的发现，陆陆续续相关的研究如雨后春笋般涌现出来，备受业界关注。因此，1997年美国国家肿瘤研究所(National Cancer Institute，NCI)对MSI检测位点的选择和诊断标准进行了规范和统一。

1997年NCI 举办的MSI研讨会上推荐的是一个简称为“2B3D”的NCI Panel，它包括5个微卫星位点，由2个单核苷酸位点（BAT-25和BAT-26）和3个双核苷酸位点（D2S123、D5S346和D17S250）组成。同时，专家组也制定了该Panel的诊断标准：若这5个微卫星位点中有2个或2个以上的微卫星不稳定，则判定为MSI-high（MSI-H），若有1个微卫星不稳定，则判定为MSI-low（MSI-L），若5个微卫星位点均稳定，则为微卫星稳定（Microsatellite stable，MSS）（图 2）。

图 2

直至今日，这个“2B3D”的NCI Panel在全球范围内都是最权威的检测标准。《中国临床肿瘤学会（CSCO）结直肠癌诊疗指南 2019版》、《结直肠癌分子标志物专家共识》（2018）、《遗传性结直肠癌临床诊治和家系管理中国专家共识》（2018）及《ESMO共识：肿瘤免疫治疗中的微卫星不稳定检测建议及其与PD-1/PD-L1表达和肿瘤突变负荷的关系》（2019）等多个国内外指南和共识均明确推荐用“2B3D” NCI Panel进行MSI检测。

在2002年，NCI举办的第二次HNPCC研讨会上对MSI的检测进行了修订和补充，除了可以选择“2B3D”NCI Panel之外，当时还推荐了另一个由5个单核苷酸微卫星位点构成的Pentaplex Panel，包括BAT-25、BAT-26、NR-21、NR-22、NR-24。有研究提示由于“2B3D”NCI Panel中含有3个双核苷酸的位点，导致其敏感性低于5个单核苷酸位点的Pentaplex Panel。 

我们可以看出其实MSI算是一个历史比较悠久的Biomarker，而随着时间的推移，它不仅没有被新的Biomarker所取代，反而在肿瘤精准医疗中的地位越来越重要，原因就是近年来免疫治疗的横空出世又让MSI火了一把。2015年，Le et al.首次在NEJM杂志上报道了MSI-H/dMMR的晚期结直肠癌患者接受帕博利珠单抗（PD-1抑制剂）的疗效显著优于pMMR患者，证明了MSI-H/dMMR的状态可以预测PD-1抑制剂的疗效。2017年同一团队又将此研究扩展到了12个不同的癌种中，结果显示MSI-H/dMMR的状态可以预测多个癌种中的帕博利珠单抗疗效（图 3）。基于此，2017年帕博利珠单抗获得FDA加速批准用于经治进展的不可切除或转移性的MSI-H/dMMR实体瘤患者，这也是FDA首次不依照肿瘤来源，而是依照生物标志物进行区分的抗肿瘤疗法。在这个肿瘤精准医疗的时代，它具有里程碑式的意义，也代表人类对肿瘤的认识更上一层楼。紧接着于2017和2018年，基于Checkmate-142的研究结果，纳武利尤单抗单药(PD-1抑制剂)和纳武利尤单抗联合低剂量伊匹木单抗(CTLA-4抑制剂)获得FDA批准用于既往治疗过的MSI-H/dMMR转移性结直肠癌患者。

多个MSI相关的免疫治疗临床研究均采用了”金标准“PCR扩增+毛细管电泳法对MSI进行检测。Checkmate-142（纳武利尤单抗）和正在进行的德瓦鲁单抗（Durvalumab）和阿维鲁单抗（Avelumab）的II期临床研究（NCT03435107和NCT03150706）选用的是“2B3D”NCI Panel对MSI状态进行评估。另外，KEYNOTE-016和KEYNOTE-059（帕博利珠单抗）临床试验选用的是美国Promega公司的MSI检测Panel，它包括BAT-25、BAT-26、NR-21、NR-24、MONO-27及两个用于质控的五核苷酸重复位点PentaC和PentaD，有研究提示该Panel在欧美人群中的敏感性高于 “2B3D”NCI Panel。

图3

近年来，市场涌现出各种MSI检测位点的试剂盒，各种各样的MSI Panel层出不穷，至于哪个更准确，目前虽无标准，但对于Panel位点的选择并未参考权威标准的推荐，且性能未经过验证的Panel是无法用于临床MSI检测的。

在过去的很长一段时间里，几乎所有的MSI相关研究都是基于欧美人群的，近些年才陆陆续续有来自于中国人群的MSI研究，这些研究发现中国人群和欧美人群的MSI发生率是存在差异的。国内外多个研究显示中国人群的MSI的发生率约为4%~13%，略低于欧美人群的MSI发生率8%~20%，而埃及人的MSI发生率高达37%，因此MSI的发生是存在人种差异的。

近期，也有研究在中国人群中对比“2B3D”和Promega这两个Panel，一项于2017年发表在Future Oncology上的国内多中心研究结果表明，对于东亚裔人群的结直肠癌患者，“2B3D” NCI Panel灵敏度（87.3%）高于Promega（71.4%）（图4）。2019年发表在Cancer Medicine上的另一项国内多中心研究，也得到了同样的结果(87.18% vs 77.78%)（图5），提示“2B3D” NCI Panel可能更适合于东亚裔人群。

图 4

图 5

综上所述，检测位点的正确姿势就是参考国内外的指南和共识中推荐的“2B3D”NCI Panel和Pentaplex Panel，且有研究提示“2B3D”NCI Panel在中国人群中敏感性更高，可能更适合中国人群。