2023年伊始，国自然申请也即将拉开序幕。你是否苦于找不到研究方向抓头挠腮？国自然还有哪些新的研究热点？“天之骄子”的单细胞测序技术面临哪些挑战？医院中海量的FFPE样本库能开展单细胞研究吗？...这么多问号，本文将一一探讨。

单细胞测序技术从问世起，就受到了科学界和产业界的极大关注，该技术在描述样本中细胞图谱信息具有独特的优势，能够高通量、快速地拿到每个细胞的基因表达信息。单细胞测序技术已经成为探究复杂组织中细胞类型、分子变化和细胞功能的重要手段，已广泛应用于临床医药和动植物领域的研究。

单细胞测序技术应用于不同物种（人类、动物、植物）的研究（Review：Jovic D, et al. 2022）

然而，单细胞技术依然面临诸多挑战，其中最大的困境是，目前绝大部分高通量单细胞测序平台对待测样本的细胞活性要求较高，但临床的大部分样本为冻存或福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）处理的组织，细胞活性极低，很难利用现有的单细胞技术进行有效检测。目前火热的单细胞测序市场，同质化竞争严重，而在临床方面又尚未找到大规模应用的突破口，单细胞市场期待着下一轮技术创新带来研究瓶颈的突破！

我们重点关注医学上一类丰富的样本资源--FFPE（Formalin Fixation and Paraffin Embedding）样本，FFPE样本库是当之无愧的病理科“瑰宝”，因为它们承载着众多疾病相关信息。FFPE也是目前长期保存病理样本的金标准，据不完全统计，在过去的几十年中，全世界医院和样本库已经存档了超过10亿的FFPE生物样品（Blow, N.S., 2007），其中，也包括动物组织的FFPE存档。在疾病病理检测中，FFPE标本成为重要的资源，有助于研究人员发现疾病病理形态、分子变化，进而辅助诊断和治疗。FFPE切片可以检测疾病的可视化特征，可以与有价值的临床数据关联起来，如患者信息记录、使用的药物，甚至临床预后结果等。FFPE技术凭借着保存时间长、可关联临床及多组学数据等诸多优点，是医学病理和机制研究、药物发现和回顾性研究的宝贵资源。

尽管FFPE保存样本对生命科学研究来说是革命性的，但这种处理方式会破坏DNA/ RNA分子，基本上会出现严重的降解情况。甲醛固定和组织包埋实验会降解FFPE组织中的RNA（Evers DL, et al. 2011），形成高度碎片化的低完整性的RNA分子，通常RNA完整性指数（RIN）<2.5（Webster AF, et al. 2015)。这让转录组层面的依赖于逆转录扩增的常规实验方法很难有效捕获到多数转录本片段。另外有研究表明，FFPE保存的样本，随着保存年限的增加，其可研究的核酸有效利用率越低。石蜡块存储4-6年后，荧光法测定的DNA量减少到47%，而且只有11%的DNA是可扩增的（Cappello F, et al. 2022）。FFPE样本核酸保留度和核酸完整性的限制成为阻碍科研及临床研究者进一步探索这类样本中蕴含的宝贵信息，使得FFPE样本无法最大程度发挥自身的价值，从而沦为沉睡的“宝藏”。

目前针对FFPE标本的转录组研究，主要还是依托于微量RNA扩增的实验方法。Trejo CL等人提出了针对FFPE标本的TempO-Seq（Templated Oligo Sequencing），该测序方法基于探针杂交的方式，不依赖逆转录，对RNA完整度有非常好的包容度，能够对人、小鼠和大鼠的全转录组进行检测。具体流程包括：载玻片上刮取感兴趣的FFPE标本区域---脱蜡处理---细胞裂解---探针杂交---去除多余探针---根据探针固定序列PCR引入测序引物---构建完整文库---测序。

FFPE标本的TempO-Seq流程（Trejo CL, et al. 2019）

FFPE-RNA-seq对于RNA质量控制一般以DV200值（200bp以上的片段占比）作为衡量参数。有研究表明，DV200>27%，即可满足下游实验管道（Pennock ND, et al. 2019）。

那么FFPE标本能开展单细胞研究吗？在单细胞技术推广这几年来，很多学者都在关心这问题，时刻期待着技术的更新。2023年伊始，我们激动地给各位学者公告，FFPE标本已经可以开展单细胞测序了！

Foley JW等人2019年在Genome Research杂志发布了激光捕获显微切割LCM + Smart-3SEQ微量扩增技术，实现了FFPE标本的单细胞检测。Smart-3SEQ结合了SMART、Smart-seq2和3’末端扩增的3SEQ方法，添加特定的UMI分子标签，实现了低RNA in put下的转录本扩增。该方法在转录组扩增层面有很大优势，尤其是从降解RNA的组织中构建转录组文库，使得FFPE标本的单细胞测序成为可能！

Smart-3SEQ文库构建流程（Foley JW, et al. 2019）

上：组织均质化+常规逆转录方法 VS 下：显微切割+Smart-3SEQ方法，后者能够检测准确的细胞类型（Foley JW, et al. 2019）

 Vallejo FV等人2022年在bioRxiv发布基于10x Genomics平台的FFPE样本的单细胞核测序方法--snPATHO-seq，该方法能够对1~2张大于25μm的FFPE切片高通量检测细胞核转录组，并实现细胞分群。解决了以往polyA方式无法捕获片段化转录本的问题。10x Genomics推出了该方法的商用试剂--Chromium Fixed RNA Profiling。

Fixed RNA Profiling实验流程

此外，国内单细胞上游企业M20 Genomics推出了VITA系列单细胞转录组的解决方案，基于随机引物的单细胞全长转录组扩增技术，能够实现对RNA非完整样本的转录本进行扩增，该技术非常适用于FFPE标本的单细胞检测。由于是随机引物的扩增方式，对于物种没有限制，原则上任何物种采用FFPE保存的标本，均可以采用该方式进行单细胞转录本的检测！

VITA单细胞实验流程

随着技术突破，FPPE单细胞测序已经成为了新的研究方向，RNA降解样本无法开展单细胞研究成为了过去式。在国自然研究课题中，涉及到诸多热门技术，诸如单细胞、空间组学（转录组、代谢组、蛋白组）、Olink、非编码RNA（miRNA、lncRNA、circRNA）、修饰组学（甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化、糖基化）、肿瘤微生物组、血液微生物组等等，依旧是研究人员非常青睐的高通量技术。随着FFPE 单细胞技术门槛被踢开，会有更多研究人员开发FFPE样本的研究潜力，宝藏样本的迸发式涌出将成为大趋势！小编检索了近几年国自然基金资助的研究目录，2022年，包括浙江大学、北京大学已经有FFPE单细胞或空间组学相关技术的研究课题。相信2023年往后，将会涌现更多基于FFPE标本开展单细胞研究的课题。

以下“FFPE样本的研究案例”和“FFPE样本的优势”来源于M20 Genomics微信公众号刊文：突破样本限制，助力临床研究

临床研究中一个重要的问题就是样本的获取。一个科学问题提出后，首先要完成的是体外实验，之后一旦要进入人体进行验证，最安全的手段是先在离体组织上进行实验验证。因为适合于课题研究的新鲜组织并不容易获得，所以FFPE这种样本类型就成为最常见的研究对象。我们在大量的临床研究中，尤其是对于病程长，预后不确定的疾病，如肿瘤，往往会使用FFPE样本进行验证，或开展回顾性研究。

以乳腺癌为例，雌激素受体阳性（ER+）乳腺癌的5年生存率大于95%，但在10-20年中，有20-40%的患者发生肿瘤转移，如果开展和疾病发展以及预后相关的研究，FFPE样本就是首选。在一项题为“RNA-seq from archival FFPE breast cancer samples: molecular pathway fidelity and novel discovery”的研究中，作者对58个在室温下保存了2-23年的乳腺癌FFPE样本进行了单基因、基因集和转录网络的调控分析。研究发现，靶向基因集可以有效地区分ER+和ER-乳腺癌。同时，调控分析发现，转录因子KDM4B与ER+分型相关，在一个独立的ER+病例队列中，KDM4B调控活性和基因表达具有预后意义。这一研究结果概述了一个可用于FFPE样本RNA-seq的通用方法，为利用FFPE组织解决乳腺癌领域的关键问题提供了解决方案，该方法可用于疾病预后判断、分子分型和治疗耐药性等方面的研究。

在医学应用方面，FFPE样本比新鲜及冷冻组织更具有优势：

杭州联川生物为全球各地的科研用户提供基因组、转录组、蛋白组、代谢组，以及单细胞和空间组学测序服务。单细胞测序作为联川战略发展方向，在组织解离和单细胞生信分析方面充分发挥自身优势，为客户提供优质的服务。目前已经与100多个国家及地区的科研院校、医院、制药公司建立起了长期的合作伙伴关系，累计发表单细胞测序相关的SCI论文近百篇，影响因子平均15+。