10余年来，晚期非小细胞肺癌的治疗经历了两大重要变革——靶向治疗和免疫治疗。靶向治疗使得晚期患者的总生存从化疗时代的10个月显著延长至39个月甚至更长。而近年来，免疫治疗的应用，更是使得晚期患者长期生存成为可能。遗憾的是，无论是靶向治疗还是免疫治疗，患者无可避免都会出现耐药，对耐药患者进行检测将有助于明确耐药机制，从而指导后续治疗。Foundation Medicine (以下简称FMI) 针对实体瘤的全面基因组测序 (CGP) 产品可一次检测315个基因，同时还可以提供TMB (肿瘤突变负荷) 及MSI信息，此外，FMI还针对血浆样本建立的检测平台。CGP检测在发现新的治疗靶点，探寻耐药机制及预后生物标志物等方面提供了重要信息。在本届的WCLC会议上，报道了众多相关研究，采用FMI CGP (Comprehensive Genomic Profiling，全面基因组测序) 检测靶向治疗或免疫治疗耐药的患者，探寻潜在的耐药机制，指导后续治疗。以下汇总CGP用于探寻靶向治疗和免疫治疗耐药机制的研究进展。

EGFR突变的晚期NSCLC对一代和二代EGFR-TKIs的耐药机制有旁路激活、下游通路活化、上皮基质转化和激酶结构域的二次耐药突变。其中EGFR T790M突变最常见，约占所有耐药人群的50%。对三代EGFR TKI奥希替尼的耐药机制研究发现，除了出现EGFR位点的3次突变C797S突变外，其他的耐药机制和一代或二代EGFR TKI类似。除上述提及的耐药机制外，既往有研究报道提示，获得性的激酶融合，如FGFR-TACC3融合，也会介导EGFR TKI的耐药。 

为进一步探索EGFR TKI耐药研究，研究采用杂交捕获的针对组织和血浆的全面基因组测序产品对患者的肿瘤组织或血浆标本进行分析。研究检测了FMI数据库中3014例既往接受或不接受过EGFR TKI治疗的EGFR突变型NSCLC(突变类型包括EGFR exon19缺失突变、L858R突变、G719X突变、L861Q突变或S768I突变)，结果发现在28例(0.9%)患者中检测到共存的活化激酶区重排，包括6个特定的激酶区，分别为BRAF激酶区12例、FGFR3激酶区5例、RET激酶区5例、ALK激酶区4例、NTRK1激酶区1例、EGFR激酶区1例。对重排后的激酶区基因进行检测，新的重排基因中，原来的激酶区基因仍然存在，其中24例激酶区基因重排的患者，检测到明确的融合伴侣。这28例患者中，21例患者既往的治疗史明确，这21例患者既往都进行了EGFR突变检测确认EGFR突变，本次进行CGP检测的标本均为接受了EGFR TKI治疗后的标本。28例患者中，25例患者除检测到EGFR突变和激酶区融合外，无其他已知的共存耐药基因。剩余3例检测到其他已知的共存耐药机制(T790M突变或MET扩增)，均为BRAF激酶区的重排，且均未发现融合伴侣。

图：28例激酶区融合基因

此外，研究者还检测了10例有EGFR TKI治疗前后配对标本的患者，在EGFR TKI治疗后的耐药标本，除检测到原发的EGFR突变外，均发现获得性的激酶融合，FGFR3-TACC3融合基因4例、EML4-ALK融合基因2例、CCDC6-RET融合基因2例、AGK-BRAF融合基因1例、TPM3-NTRK1融合基因1例。值得注意的是，其中3例患者治疗前的标本检测到T790M突变，经过3代EGFR TKI治疗后，T790M突变消失，只检测到原来的EGFR敏感突变和融合基因 (FGFR3融合基因2例和BRAF融合基因1例) 。

图：EGFR-TKI治疗前后的配对标本检测 

在WCLC会议现场，Sai-Hong Ignatius Ou教授还分享了1例EGFR突变患者在接受EGFR TKI治疗过程中，多次活检的基因突变检测结果，如下图所示。患者是1例67岁亚裔非吸烟女性，首诊为IV期NSCLC，合并脑转移，基因检测结果显示EGFR L858R突变，ALK和ROS1 FISH检测均为阴性，在接受全脑放疗后，给予一线厄洛替尼治疗，进展后，采用尿液标本继续液体活检发现EGFR L858R突变和T790M突变，二线给予阿法替尼治疗很快进展，三线接受奥希替尼治疗，耐药后再次采用ctDNA液体活检，检测到EGFR L858R突变和PLEKHA7-ALK基因融合，T790M突变消失，四线给予奥希替尼+alectinib治疗。这一病例提示，在患者中治疗过程中，进行动态的分子检测，可以明确耐药突变以指导后续治疗。以患者的血浆ctDNA标本进行CGP检测，发现奥希替尼治疗后，患者的T790M突变消失，并发现获得性PLEKHA7-ALK基因融合，提示激酶区融合是EGFR TKI的耐药机制之一。

图：在患者治疗过程中进行动态分子检测

小结：获得性激酶融合是EGFR突变患者接受EGFR TKI耐药后的耐药机制之一，尽管发现率较低。本研究提示，CGP可以对EGFR TKI治疗前和治疗后的标本进行不同的融合基因检测，这将有助于指导患者的临床治疗。 

EGFR T790M突变是一代和二代EGFR TKI获得性耐药最常见的耐药机制。目前，奥希替尼已经获批用于EGFR T790M突变的NSCLC。然而，随着奥希替尼的临床应用，奥希替尼的耐药成为新的临床问题。对EGFR T790M突变的接受奥希替尼治疗后耐药的NSCLC患者，进行耐药机制检测，是非常有必要的。明确奥希替尼的耐药机制将有助于指导后续的治疗选择。

本研究首先对2011年1月至2017年8月期间收集的晚期NSCLC患者的血液和组织标本进行T790M检测。对EGFR T790M突变的患者，回顾电子病例，收集一般的临床资料，病灶患者耐药后，建议其接受奥希替尼治疗。研究共检测到51例EGFR T790M突变的患者，其中35例接受了奥希替尼治疗，16例未接受奥希替尼治疗。对比两组患者的总生存，结果显示，未接受奥希替尼治疗的患者，中位OS为4.34个月，而奥希替尼治疗组为25.8个月。接受奥希替尼治疗的35例患者，10例已经进展。采用CGP检测发现，10例耐药的患者中 (同一患者可能同时检测到不同的耐药机制) ，8例(80%, 8/10)检测到依赖EGFR通路的耐药机制，分别为EGFR突变位点的3次突变，C797S突变3例，C797G突变1例；EGFR T790M突变消失的3例；EGFR基因扩增的3例。检测存在独立于EGFR通路耐药机制的患者6例(60%, 6/10)，其中旁路激活者4例，分别为HER2扩增的3例、MET扩增的1例；下游通路活化的患者2例，分别为MAPK/ERK通路活化(KRAS扩增)1例、PI3K/AKT通路活化(AKT3和PIK3C2B扩增)1例；其他耐药机制3例，包括RET NCOA4基因融合1例、MYC扩增1例、细胞周期基因扩增2例。

图：10例奥希替尼耐药患者的耐药分子机制 

小结：目前关于奥希替尼的耐药机制尚未明确，本研究对奥希替尼耐药后的患者进行CGP检测，除检测到EGFR位点的三次突变外(C797S突变)，还发现了其他一些潜在的耐药机制，包括EGFR和ERBB2的扩增、MET扩增、MAPK和 PI3K/AKT通路的变异等。本研究提示，对耐药后的患者进行CGP检测，可以发现潜在的耐药机制，从而指导后续的治疗选择。 

既往的研究显示，KRAS突变的NSCLC根据其共存突变基因，主要可以分为3种类型：KP型(KRAS突变和TP53突变)、KL型(KRAS突变和STK11突变/LKB1失活)、KC型(KRAS突变和CDKN2A失活)。进一步对KL型肿瘤进行分析，发现这类肿瘤为“冷肿瘤”，动物研究提示这类肿瘤对免疫治疗原发耐药。那么临床上KL型的肿瘤患者是否对PD-1/PD-L1抑制剂原发耐药呢？为了验证这一临床前研究，研究者回顾性的分析了174例接受了免疫治疗的KRAS突变型晚期NSCLC患者(简称为SU2C队列)，患者主要接受免疫检查点抑制剂单药治疗，其中nivolumab治疗的患者占83.5%，pembrolizumab治疗的患者占11.7%，其余4.8% 的患者接受抗PD1/PD-L1抑制剂+抗CTLA-4抑制剂。研究同时还纳入了FMI数据库中924例接受CGP检测的肺腺癌患者(简称为FMI队列)，这些患者基因状态明确且接受过至少1次的免疫治疗。SU2C队列和FMI队列分别采用E1L3N IHC和VENTANA PD-L1(SP142)检测PD-L1的表达状态。 

在173例可以进行疗效评价的患者中，KL型患者接受免疫治疗的ORR最低，KL型，KP型和只有KRAS突变的患者，ORR分别为7.4%，35.7%和28.6%，三组差异有统计学意义，P=0.000735。

左图：不同KRAS突变型患者接受免疫治疗的ORR对比；

右图：不同KRAS突变型患者接受免疫治疗的疗效瀑布图。

比较不同KRAS突变型患者接受免疫治疗的PFS，结果显示，KL型患者的PFS最短，为1.8个月，而KP型患者为3个月，仅有KRAS突变型的患者为2.7个月，三组PFS有统计学差异(P=0.0018)。单独比较KL型患者和KRAS突变STK11野生型的患者，结果显示两组PFS亦存在显著差异，mPFS分别为1.8个月和2.7个月，HR=1.87(95%CI：1.32-2.66)，P=0.00038。

左图：不同KRAS突变型患者接受免疫治疗的PFS对比；

右图：KL型和KRAS突变STK11野生型的患者接受免疫治疗的PFS对比。

进一步比较不同KRAS突变型患者的OS，结果显示，KL型患者的OS最短，为6.4个月，KP型患者为16.0个月，仅有KRAS突变型的患者为16.1个月，三组OS有统计学差异(P=0.0045)。单独比较KL型患者和KRAS突变STK11野生型的患者，结果显示两组OS亦存在显著差异，mOS分别为6.4个月和16.0个月，HR=1.99 (95%CI：1.29-3.06) ，P=0.0015。

左图：不同KRAS突变型患者的OS对比；

右图：KL型和KRAS突变STK11野生型的患者的OS对比。

为评估STK11突变患者免疫相关疗效标志物的特征，研究者分析了FMI数据库中924例肺腺癌患者的分子特征，这些患者中均接受过CGP检测和PD-L1的免疫组化检测。根据患者肿瘤突变负荷(TMB)的高低和PD-L1表达的高低分别分为3组，结果显示，在TMB高和中等且PD-L1表达阴性的这类患者中，STK11是最常见的变异基因。

图：TMB高和中等且PD-L1表达阴性的这类患者进行基因谱分析，STK11是最常见的变异基因。 

对FMI队列和SU2C队列中不同KRAS分型的患者进行PD-L1表达水平的分析，结果显示，FMI队列中，KL型患者中，PD-L1低表达或不表达的患者中比例较高。SUC2队列中，KL型患者，86.4%的患者PD-L1不表达，3组患者PD-L1表达水平有统计学差异。

图：FMI队列和SU2C队列中，不同KRAS亚型患者PD-L1的表达水平

值得一提的是，研究者进一步对SU2C队列中PD-L1表达阴性的患者进行分析，结果发现，在PD-L1表达阴性的患者中，不同KRAS突变型患者接受免疫治疗的ORR显著不同。其中10例PD-L1阴性的KP型患者接受免疫治疗, 3例PR, 4例SD, ORR为30%(3/10)，而PD-L1阴性的KL型和单纯KRAS突变型患者，免疫治疗的ORR分别为5.3%(1/19)和5.9%(1/17)，差异有统计学意义，P=0.034。

图：对PD-L1表达阴性对不同KRAS突变型，接受免疫治疗的患者进行疗效比较。 

小结：在KRAS突变的NSCLC患者中，STK11失活突变介导了免疫治疗的原发耐药。SKT11失活突变主要见于TMB中等/高且PD-L1表达阴性的肺腺癌患者，与“冷”的肿瘤微环境相关。TP53的共突变强烈预示患者能够从PD-1抑制剂治疗中获益，即使是PD-1表达阴性的患者。这一科学发现将支持后续进行更多研究，可以考虑对KL型患者采用免疫治疗+靶向治疗的策略，以期重新激活患者的抗肿瘤免疫反应。

以上3项研究分别对靶向治疗和免疫治疗耐药的患者进行CGP检测，探寻潜在的耐药机制，从而指导后续治疗，研究具有一定的临床转化价值。 

               

胡洁

教授

复旦大学附属中山医院胸部肿瘤和呼吸介入科副主任

上海市呼吸病研究所细胞和分子生物实验室副主任
美国胸科医师学院ACCP资深会员（FCCP）
中国医师协会呼吸医师分会肺癌专业委员会委员、秘书
中国临床肿瘤学会青年委员会常委
上海市抗癌协会肿瘤呼吸内镜专业委员会

常委

上海市医学会呼吸专业委员会肺癌学组委员

晚期NSCLC患者经历一代、二代、三代EGFR TKI的治疗，总会面临靶向耐药的问题。编号为10309的研究采用FMI CGP检测提示EGFR常见突变的患者接受TKI治疗后，有0.9%(28例)的患者检测到共存的活化激酶区重排(BRAF、FGFR3、RET、ALK、NTRK1、EGFR)。研究者还检测了10例有EGFR TKI治疗前后配对标本的患者，在EGFR TKI治疗后的耐药标本，除检测到原发的EGFR突变外，均发现获得性的激酶融合。此研究提示激酶区融合是EGFR TKI的耐药机制之一，未来对后续治疗也提出了新的挑战，需要更多实践来为此类患者找到更精准的治疗方案，幸运的是针对BRAF、FGFR3、RET、ALK、NTRK1、EGFR或已经上市，或正在研发。因此，采用CGP对靶向耐药对患者进行耐药机制检测，将指导耐药后的精准治疗。 

T790M突变的发现和三代EGFR TKI奥希替尼的应用，开启了耐药后精准克服靶向耐药的新时代。然而，不可避免的是，奥希替尼治疗后也会出现耐药，随着临床上奥希替尼的广泛应用，对奥希替尼的耐药机制研究成为新的课题。编号为9555的研究采用FMI CGP对EGFR TKI耐药后T790M突变接受奥希替尼治疗后耐药后的患者进行检测，探索奥希替尼的耐药机制，主要包括：1. 依赖EGFR的耐药机制，如EGFR突变位点的3次突变(C797S突变和C797G突变)，EGFR T790M消失，EGFR扩增；2. 独立于EGFR的耐药机制，如旁路激活(HER2扩增，MET扩增)、下游通路的活化(MAPK/ERK通路活化，PI3K/AKT通路活化)及其他通路基因引起的耐药机制，如RET NCOA4基因融合，MYC扩增，细胞周期基因扩增。相比一代耐药机制而言，涉及的基因改变更为宽泛。上述耐药机制的探索，为后续临床上探索新的联合治疗策略以克服三代EGFR TKI的耐药提供重要依据。随着奥希替尼用于EGFR突变的晚期NSCLC一线治疗的研究FLAURA取得阳性结果，NCCN指南已将奥希替尼纳入晚期EGFR敏感突变NSCLC一线治疗选择。但这样的选择是否一定是最佳的，从全程管理的角度去思考，如何克服奥希替尼的耐药将是一大难题。对奥希替尼耐药机制的研究，将有助于指导后续的临床用药，真正实现精准治疗。

近年来，免疫治疗是晚期NSCLC治疗史上的重大变革。但总体而言，免疫抑制剂单药治疗面临着有效率较低的困境(不加筛选人群，免疫治疗的ORR为20%左右)。编号为10367的研究，采用全面基因组测序对KRAS突变型的NSCLC患者进行进一步的细分，发现KRAS突变伴STK11失活突变组接受PD-1/PD-L1抑制剂PFS和OS更差，介导了免疫治疗的原发耐药。这一发现提示KRAS突变合并的伴随突变不同，对IO的疗效不同，因此未来除了需要对驱动基因的状态做评估之外，还需同时检测可能影响疗效的伴随突变。此外，研究还发现，SKT11失活突变多见于TMB中等/高且PD-L1表达阴性的肺腺癌患者，与“冷”的肿瘤免疫微环境相关。这一发现将PD-L1和TMB这两个相对独立的免疫标识物联系起来，提示在中～高TMB的这部分理论上IO可能有高生存获益的肺癌患者中，STK11失活可以是原发耐药的机制之一。更重要的是，未来如果需要进行IO疗效预测标志物的检测，绝不会是仅限于PD-L1、TMB的单一检测，而必将利用全面基因组测序，进行多基因的平行检测，明确患者的免疫状态分型，为后续制定个体化的免疫治疗策略提高重要依据。当然，这一研究也有不足之处，是一个回顾性的小样本的研究，终究需要经过大样本的验证。此外，研究没有深度挖掘和呈现出STK11与TMB、PD-L1之间在机制上的联通点。但无论如何，这一研究具有重要的临床转化意义，根据患者的免疫活化状态来治疗相应的免疫治疗策略，将使得免疫治疗可以惠及更广人群，取得更大获益。