作者：郑瑞娟，徐费凡，黄晓辰，王洁，冯永红，黄劲，秦莲花

第一作者及单位：郑瑞娟，上海市结核病（肺）重点实验室/上海市肺科医院/同济大学医学院；徐费凡，南通市第六人民医院检验科

通信作者及单位：秦莲花，上海市结核病（肺）重点实验室/上海市肺科医院/同济大学医学院；黄劲，贵州医科大学环境污染监测与疾病防治教育部重点实验室/贵州医科大学生物化学与分子生物学系

Evaluation of Aptamer Fluorescence Microscopy in the Diagnosis of Pulmonary Tuberculosis

Zheng R, Xu F, Huang X, Wang J, Feng Y, Huang J, Qin L.

Microbiol Spectr，2022 Jun 14：e0260221.

doi: 10.1128/spectrum.02602-21.

PMID: 35699468.

研究背景

细菌学检测是结核病（tuberculosis，TB）诊断的“金标准”，主要包括痰分枝杆菌培养和痰抗酸杆菌涂片染色显微镜检查。由于结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）生长缓慢、培养耗时长，难以快速获得结果，使得价廉快速的痰涂片镜检成为TB早期诊断的重要手段。尽管快速灵敏的分子检测提高了TB诊断的效率，但目前还难以替代或降低对涂片和培养的需求。在可预见的未来，显微镜检查仍可能是偏远地区和低收入国家TB实验室诊断的主要检测方法。但目前使用的痰涂片显微镜检存在两大缺点，一是敏感度低，二是不能鉴别MTB与非结核分枝杆菌（non-tuberculosis mycobacteria，NTM）。因此，改进涂片显微镜检测方法以解决这一技术在TB临床诊断中存在的问题是十分必要的。

研究方法·

1. 适配体的制备：以前期研究获得的MTB特异性适配体MA1为基础，根据其二级结构构建衍生适配体，并通过亲和性检测获得具有更高亲和性的适配体探针用于临床诊断评估。

2.适配体荧光显微镜检测方法的构建：（1）用异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）标记适配体，构建适配体荧光显微镜检测体系。（2）在56株纯培养菌株（包括MTB菌株、NTM菌株）中，初步评估适配体荧光显微镜法的检测效果。

3.适配体对临床痰标本检测效果评估：（1）检测标本：为169份疑似肺结核患者和肺结核患者以外的肺部疾病患者的痰标本。（2）痰标本的常规细菌学检测：痰培养和抗酸杆菌涂片镜检。（3）痰标本的分子生物学检测：分枝杆菌属16SrRNA和MTB复合群特征序列IS6110的PCR扩增检测；16SrRNA测序及序列同源性比对进行分子菌种鉴定。（4）痰标本的适配体荧光显微镜检测。（5）统计学分析抗酸染色涂片镜检和适配体荧光显微镜方法在敏感度、特异度、阳性预测值（positive predictive value ，PPV）和阴性预测值（negative predictive value，NPV）上的差异。

研究结果·

1.高亲和性适配体MA1-39的获得与验证：利用酶联免疫吸附试验检测各衍生适配体与MTB标准菌株H37Rv的结合作用。具有口袋-茎-环结构的MA1-39衍生适配体展现出与H37Rv最高的亲和性。构建MA1-39适配体FITC荧光显微镜检测体系，并用纯培养菌株对其检测效果进行测试。结果显示，在测试的56株菌株中，MA1-39适配体荧光显微镜检测体系能有效地将MTB与NTM区分开来（图1）。

图1  MA1-39适配体荧光显微镜对MTB的鉴别检测（×40）。（A）对培养菌株的检测。MTB-17和MTB-23为MTB分离菌株；对照1（control 1）为NTM分离菌株；对照2（control 2）为NTM分离菌株。（B）对临床痰标本的检测。TB-47为TB患者的痰液样本；non-TB-57为非TB患者的痰液样本

2.适配体对临床痰标本的检测效果：将MA1-39荧光显微镜检测体系用于169份临床痰样本的检测（图1，表1）。通过与分子检测、临床诊断和细菌学测试结果相比较，分析适配体的检测效果（表1）。

与传统的抗酸染色法相比（表2），适配体荧光显微镜法对临床标本中MTB的检出率更高（48.8% vs.32.6%），但两种技术的特异度差异无统计学意义（90.4% vs. 94 %）。此外，适配体荧光显微镜法的阳性预测值（PPV）与抗酸染色法基本相同（84% vs.84.9%），但阴性预测值（NPV）却更高（63% vs. 57.3%）。

研究结论

本研究建立的适配体荧光显微镜法可快速检测临床痰标本中的MTB，是一种新型有效的TB细菌学检测方法。

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译稿：秦莲花

编辑：孟    莉

审校：范永德

发布时间：2022-06-30

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