靶向CD19的Car-T细胞（上）识别并攻击血液肿瘤细胞（下）的艺术图，CD19草绿色，CAR粉红色，perforin紫色，granzyme洋红色

2017年无疑是Car-T细胞疗法的元年。先是在今年 6月，南京传奇在ASCO会议上公布了经其Car-T疗法LCAR-B38M治疗的35位患者中94%出现临床缓解，成为来自中国的超级黑马。随后，Novartis和Kite Pharma的Car-T疗法在8月和10月相继获得美国FDA的上市批准，而Juno Therapeutics的Car-T疗法JCAR017也有望在2018年初获准上市。我国政府继去年年底要求按药品评审原则处理细胞制品后，又在今年10月规定临床试验由明示改为默示，从政策上为细胞免疫治疗简化审评审批流程。在2017年最后一个月里，南京传奇、成都银河（联合北京马力喏和四川大学）和上海恒润达所提交的Car-T细胞制剂临床申请先后获得CFDA药品审评中心的受理。以上细胞疗法都是围绕血液肿瘤，除LCAR-B38M靶向BCMA外，其余 5种Car-T都是靶向CD19。

我们在为Car-T细胞治疗取得的突破感到兴奋的同时，需要认识到取得较高临床缓解率的Car-T疗法主要集中作用于CD19靶点。CD19是一种重要的B细胞信号分子，出现在几乎所有B细胞表面，B细胞白血病和淋巴瘤的癌细胞表面也存在CD19。考虑到正常的B细胞可以通过外界输入来补充，并且T细胞和B细胞在空间上有很大的重合度，使用设计简单的嵌合T细胞受体（图1. chimeric antigen receptor，CAR）即可取得对B细胞血液肿瘤的良好治疗效果，而不需要特别考虑Car-T细胞的运输和浸润。但将同样的CAR应用于治疗实体瘤就会困难重重。在今天的2017年终特别篇里，我们就来从最新的实体瘤Car-T临床试验角度来认识T细胞浸润的重要性。

图1. 嵌合T细胞受体（CAR）由单克隆抗体经生物工程改造而来，图为第一代的CAR模型（蓝色的ZAP70为细胞内信号分子），包括抗原结合区域single chain Fv（含heavychain、linker和light chain）、跨膜区域transmembrane domain和细胞信号区域CD3ζ（图片来自PDB-101）

2015年，Novartis和UPenn在ASCO会议上介绍过靶向mesothelin的Car-T在实体瘤I期临床试验的中期结果（AbstractCT105）。Mesothelin在正常间皮细胞中表达，也在卵巢癌、间皮瘤和胰腺癌中过表达。5位晚期实体瘤患者（2位卵巢癌、2位间皮瘤、1位胰腺癌）在接受CART-meso回输后，虽然未观察到重大不良事件发生，但只有1位在影像学和临床指标中得到了病情稳定和肿瘤开始萎缩的迹象，可以说临床效果一般。Car-T技术的发明人，Carl June教授此后继续CART-meso的临床研究，并于今年报告了首例实体瘤患者在接受CART-meso回输后出现了疑似血液肿瘤CD19 Car-T治疗中标志性的细胞因子释放综合征（cytokine release syndrome，CRS，也叫细胞因子风暴），认为这可能与T细胞激活和增殖相关（Janos et al., 2017）。该名BRCA1突变阳性的晚期卵巢癌患者在接受治疗后出现持续的胸膜液增多，后期（day21-29）平均每天排出近2L的胸膜液，最终在接受治疗后的第29天去世（在家属决定停止治疗后）。从该名卵巢癌患者的组织样本可以看出，回输的CART-meso在胸膜液中大量富集，但同时也出现在了身体的其它器官和组织中（图2）。从这项研究能够看出Car-T细胞运输并浸润至正确的肿瘤病灶关系到患者的生命安全。

图2. 在接受CART-meso治疗的乳腺癌患者去世后3.5小时内，通过qPCR检测在其肿瘤和正常组织样本到发现多个部位中存在CART-meso细胞（Janos et al., 2017）

相比Novartis的CART-meso，Mustang Bio研发的实体瘤 IL13BBζ–CART（靶向IL13Rα2，脑瘤中的一种常见受体）取得了更令人兴奋的结果。 参与IL13BBζ–CARTI期临床试验（编号NCT02208362）的1位胶质母细胞瘤患者，在接受16次细胞药物回输后多处病灶显著缩小，部分病灶甚至消失（图3），并且临床反应长达7.5个月（Brown et al., 2016）。 需要指出的是，该案例中CART-meso的回输是通过直接注射到肿瘤切除后的空腔或脑室内，而非通过静脉注射，因为静脉注射的Car-T细胞很难突破血脑屏障到达病灶。从治疗相应度来看，注射到肿瘤切除后的空腔中的Car-T细胞只能控制局部的肿瘤病灶，但注射到脑室内的Car-T能够将所有的肿瘤病灶的体积惊人地清除掉77％到100% （影像学上病灶完全消失），包括在脊柱位置的转移灶。 虽然该患者在接受Car-T治疗后的第108天回归正常生活，但还是在第228天出现复发，4个新发病灶不在已被Car-T清除的病灶附近。初步分析结果显示，新发病灶中肿瘤细胞的靶点蛋白IL13Rα2表达量下降。从这项研究能够看出Car-T细胞的输入部位对治疗效果至关重要。同时，即使对治疗响应的患者，也会因为肿瘤的异质性和不断演化而最终产生耐药性。

图3. 一位50岁的多灶型胶质母细胞瘤患者在接受多次IL13BBζ–CART（靶向IL13Rα2）回输后，影像学上可以看到患者颅腔内多处的病灶对治疗敏感（Brown et al., 2016）

上述两个案例中，实体瘤的Car-T靶点既存在非肿瘤特异性（如mesothelin），又存在靶点丢失的情况（如IL13Rα2）。所以，选择靶点是Car-T细胞治疗的核心问题之一，因为不仅关系到治疗的毒性和疗效，还关系到研发成本和市场规模。尽管许多国内的基因检测公司都在如火如荼地收集肿瘤基因数据，但这些数据内容单一且表型验证结果缺失，无法帮助选择更合适的Car-T目标靶点。成立于2007年，总部位于比利时的Celyad公司对此提出了独特的解决方案：采用来自于自然杀伤细胞（NKcell）的受体蛋白NKG2D（Natural Killer Group 2D，NKR-2）来靶向80%的肿瘤，包括血液肿瘤和实体瘤。已知有8种 induced-self抗原能够作为NKG2D受体蛋白的配体。这些配体的mRNA在正常的人体细胞中广泛存在，但细胞表面的蛋白表达非常少。当细胞遇到感染或癌变等压力时，这些标记“自身细胞异常”的induced-self 抗原快速在细胞表面表达，标记出存在问题的细胞等待NK细胞来清理。肿瘤细胞逃逸NKG2D介导的清除可能涉及多种机制，相关的研究暂时有限。Celyad公司将NKG2D与CD3ζ连接，设计出NKR-2 CART（图4）。由于NKG2D蛋白的跨膜区能够与两个DAP10蛋白单体结合，当NKRG2D与肿瘤细胞表面的induced-self 抗原结合时，相当于同时激活了CD3ζ和CD28下游的信号通路，所以NKR-2 CART的实际生物功能相当于第二代Car-T（含CD3ζ和CD28），但靶向的肿瘤类型更为广谱。今年3月，FDA宣布批准Celyad在美国展开NKR-2CART的“THINK”（THerapeuticImmunotherapy with CAR-T NKG2D） Ib期临床试验。Celyad计划在欧洲和美国招募5种实体瘤和2种血液肿瘤的共84位患者入组，包括结直肠癌、尿路上皮癌、三阴性乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌、急性髓系白血病（AML）、多发性髓系白血病。在6月，Celyad公布部分入组THINK临床试验的实体瘤患者的随访情况， 无进展生存期（PFS）中位数在1.9到3.2个月之间。而在10月，Celyad宣布入组THINK临床试验3位血液肿瘤患者中，已有1位在接受NKR-2 CAR T的患者出现完全缓解（CR，即所有靶病灶消失，无新病灶出现，维持1个月以上）。从“THINK”的初步结果看，即使是广谱的肿瘤靶点，Car-T疗法在血液肿瘤中的疗效依然优于实体瘤，这其中部分原因依然是T细胞浸润的困难。

图4. 普通第二代CAR（A）的靶向结合区域来自单克隆抗体，而 Celyad公司的CYAD-01（B）的靶向结合区域来自NK细胞的NKG2D（Gilham and Maher, 2017）

讲到这里，说些题外话。不知读者以前是否注意到，很多Car-T的研究都着重介绍如何通过生物工程技术载入CAR的基因序列，却很少能解释清楚T细胞是否依然保持原有T细胞受体（TCR）的功能。如果T细胞原本的TCR和后载入的CAR同时发挥功能，这就无法从根本上排除脱靶和细胞毒性问题，Car-T疗法也不可能实现细胞来源更广、生产成本更低的普惠愿景。目前，产业界有两类策略来实现异体Car-T治疗：1）像Bellicum等，通过服用化学药物来诱导异体Car-T细胞凋亡（CaspaCIDe技术）；2）像Cellectis和Celyad，通过关掉TCR的表达（图5）或干扰TCR功能来制造TCR-deficient Car-T。此前，Pfizer已通过与Cellectis签署合作协议来共同开发Universal Car-T平台技术，挑战Juno和Ceylad，该协议的预付款高达8000万美元。Celyad在2015年在美国获得业内首个同种异体TCR-deficient Car-T专利授权（US Patent 09181527）。今年5月，已向Novartis授予其独特的同种异体CAR-T平台专利的非独占许可，潜在价值为9600万美元。此外，新锐生物科技公司Rubius掌握的红细胞脱核（enucleation）技术在未来可能也会用来制造异体Car-T细胞（图6）。今后，细胞治疗产业可能出现类似苹果、谷歌、三星之间打官司一样的专利壁垒攻防战。

图5. Cellectis的UCART利用Talen细胞编辑技术将原本的TCR“关掉”，实现异体Car-T治疗（图片来自Cellectis官网）

图6. Rubius的红细胞脱核技术未来可能成为多种基于细胞的生物治疗（包括Car-T治疗）的平台技术 （图片来自Rubius官网）

回归正题，无论是同属第二代CAR技术的Novartis CART-meso，Mustang Bio IL13BBζ–CART还是Celyad NKR-2 CART，想在实体瘤Car-T领域取得类似靶向CD19的Car-T在血液肿瘤中的治疗效果都必须面对肿瘤免疫学的“三重门”：1）找到并验证肿瘤抗原（本系列上一篇已介绍）；2）Car-T细胞运输并浸润至肿瘤病灶（否则将带来off-tumor, on-target毒性，将在本系列下一篇介绍）；3）克服免疫抑制性的肿瘤微环境，并应对肿瘤细胞的异质性。相信读者看到这里，已经从实例中体会到有效的T细胞运输和浸润在免疫治疗中的重要性。针对这一问题，麻省理工和西雅图华盛顿大学今年发表研究文章，从工程学上角度提出了一种解决方案。研究人员利用可植入的生物聚合材料作为运载体，将Car-T细胞直接植入实体瘤附近，在一段时间内创造出很高的Car-T细胞浓度，最终利用“人海战术”来突破实体瘤的免疫异质性微环境（Smith et al, 2017)。推荐读者阅读这篇文章，在2018年元旦大开一下脑洞：《Biopolymers co-delivering engineered T cells andSTING agonists can eliminate heterogeneous tumors》

在2017年年终之际，感谢您阅读本系列的2018跨年特别篇！在新一期的肿瘤免疫治疗系列中，我们将继续讨论激活的T细胞从血液循环系统浸润至肿瘤病灶需要面对的免疫抑制环境—《分析肿瘤微环境中的免疫逃逸机制 2》。