炎症性肠病（IBD）是一种病因未明的胃肠道非特异性、慢性、复发性、炎症性疾病，主要包括溃疡性结肠炎（UC）和克罗恩病（CD）两种类型，又称为“绿色癌症”。

目前认为，肠道微生物群落及其代谢产物、宿主易感基因，以及宿主肠道粘膜先天性或获得免疫应答失衡三方面相互影响，在炎症性肠病的发病过程中有重要作用。

全球有超过1000万的人罹患炎症性肠病，我国的发病率为1.77/10万~3.14/10万。正确诊断炎症性肠病并立即开始治疗，对于避免疾病进展带来的并发症很重要。

2022年8月30日，意大利罗马大学Laura Stronat教授团队在Journal of Crohn's and Colitis上发表了题为Proteomic Analysis Identifies Three Reliable Biomarkers of Intestinal Inflammation in the Stools of Patients With Inflammatory Bowel Disease的文章，利用蛋白组学检测，从粪便样品中鉴定了三种新型炎症性肠病生物标志物（糜蛋白酶C、Gelsolin和RhoGDI2），在识别炎症性肠病方面具有较好的特异性和敏感性，并与炎症性肠病的严重程度呈显著相关。

典型的内镜和影像学检查是评估炎症性肠病患者疾病进展和粘膜严重程度的金标准，但该检查有侵袭性、成本较高、患者接受度较差。研究者对无创的血清和粪便生物标志物越来越感兴趣，但目前的实验室检查手段对炎症性肠病的诊断价值也有限，血液生化指标如C反应蛋白（CRP）和红细胞沉降率（ESR）在临床实践中虽具有重要意义，但其特异性有限。

粪便中的生物标志物作为无创、客观检测肠道炎症的方法，与血清生物标志物相比，对肠道炎症的敏感性和特异性更好，粪便与肠道黏膜直接接触，确保生物标志物浓度可反映肠道炎症的严重程度。因此，粪便生物标志物是评估疾病活动度、治疗响应和间接预测复发风险的理想检测手段。

粪便钙卫蛋白（FC）体现了黏膜的病变程度，在炎症性肠病的治疗中具有重要的指导作用，是监测黏膜炎症状态和评估患者对治疗响应的最有价值的非侵入性工具。然而，钙卫蛋白似乎特异性不足，除了炎症性肠病可引起粪便钙卫蛋白升高，其它的肠道疾病如传染性肠炎、十二指肠炎、结直肠肿瘤、息肉、憩室炎，食物不耐受或非甾体抗炎药的使用，甚至接受盆腔放疗也可引起其升高。目前缺乏公认的临界值。

利用蛋白质组学检测技术，研究者们在活动性克罗恩病患者或缓解期患者和对照组的粪便中识别出了新的肠道性炎症生物标志物。经检测，筛选到21种蛋白在患者和对照组之间存在差异表达，研究者从中选择了3个潜在的生物标志物糜蛋白酶C、 Gelsolin、RhoGDI2，在更大人群的克罗恩病患者队列中进行验证，并将该分析扩展到溃疡性结肠炎患者。研究者们首次发现，粪便中的糜蛋白酶C、Gelsolin和RhoGDI2可提示炎症性肠病患者是否存在炎症，且和严重程度显著相关。这三种蛋白，特别是RhoGDI2，具有非常高的敏感性和特异性，成为炎症性肠病诊断和治疗监测的有效手段。

MALDI-TOF/TOF 质谱进行蛋白检测

凝胶电泳蛋白斑点经胰蛋白酶消化、脱盐等前处理，AB Sciex基质辅助激光解析飞行时间质谱（MALDI-TOF）/TOF平台进行蛋白质检测。MALDI-TOF/TOF质谱分析发现了21种蛋白，其中乳糜蛋白酶C、Gelsolin和RhoGDI2在克罗恩病患者粪便中升高的最多。

▲MALDI-TOF/TOF质谱鉴定的21种蛋白列表

酶联免疫（ELISA）法定量分析三种粪便蛋白

定量ELISA试剂盒检测粪便样品中的糜蛋白酶C、Gelsolin和RhoGDI2水平。粪便样品用稀释液缓冲液稀释，稀释比例为1：5（糜蛋白酶C）和1：50（Gelsolin和RhoGDI2）。分光光度法450nm波长下检测吸光度。糜蛋白酶C和RhoGDI2的粪便蛋白浓度单位为ng/ml，Gelsolin的蛋白浓度单位为pg/ml。

钙卫蛋白的检测用商业化定量ELISA试剂盒。稀释比例为1：250，钙卫蛋白单位为µg/g。ELISA法分别对患者和对照队列样本进行检测。117例炎症性肠病患者队列（57例溃疡性结肠炎：中位年龄46岁，60例克罗恩病：中位年龄49.6岁）和31例年龄匹配的对照组队列（中位年龄45.8岁），患者根据疾病严重程度分为克罗恩病和溃疡性结肠炎（重度、中度、轻度），结果发现糜蛋白酶C、Gelsolin和RhoGDI2与溃疡性结肠炎和克罗恩病患者肠道性炎症的发生和严重程度显著相关。

研究者们同步检测了粪便中的钙卫蛋白，发现在肠道性炎症患者中，其水平显著升高。

▲克罗恩病（CD）和溃疡性结肠炎（UC）患者中乳糜蛋白酶C、Gelsolin、RhoGDI2和钙卫蛋白水平

此外，比较溃疡性结肠炎或克罗恩病亚组内（轻度、中度、重度）的粪便蛋白水平。

▲糜蛋白酶C、Gelsolin、RhoGDI2与钙卫蛋白呈正相关（A）克罗恩病-CD ；（B）肠道性炎症-UC 

ROC曲线分析显示，Gelsolin和RhoGDI2在检测克罗恩病者肠道炎症的发生和严重程度方面具有更高的敏感性和特异性。根据曲线下面积（AUC）数据显示，三种生物标志物对区分克罗恩病和溃疡性结肠炎患者与对照组都具有较高的敏感性和特异性。总的来说，将新的生物标志物与钙卫蛋白进行比较，研究者们发现Gelsolin和RhoGDI2比钙卫蛋白具有更优的AUC值，能够更有效地区分炎症性肠病患者和对照组。此外，在克罗恩病样本中，Gelsolin和RhoGDI2优于钙卫蛋白。在溃疡性结肠炎患者中，糜蛋白酶C与钙卫蛋白p=0.37）和Gelsolin与钙卫蛋白（p=0.35）之间的差异没有统计学意义，而RhoGDI2与钙卫蛋白的比较差异比较显著，p值为0.0004。

▲糜蛋白酶 C、Gelsolin、RhoGDI2和钙卫蛋白 ROC曲线用于区分克罗恩病（CD）（A）和溃疡性结肠炎（UC）（B）患者与对照组

最后，ROC曲线分析区分活动性疾病的差异，与钙卫蛋白相比，Gelsolin在缓解期患者与活动性疾病患者中具有更高的特异性和敏感性（p=0.009）。

总之，研究者们建议用糜蛋白酶C、Gelsolin和RhoGDI2来检测和监测高、低级别肠道性炎症。下一步将进一步评估该标志物组合对于预测肠道性炎症、其他炎症性胃肠道疾病复发和治疗反应的能力。

参考资料

Vitali R, Palone F, Armuzzi A, et al. Proteomic analysis identifies three reliable biomarkers of intestinal inflammation in the stools of patients with Inflammatory Bowel Disease. J Crohns Colitis. 2022 Aug 30:jjac110. doi: 10.1093/ecco-jcc/jjac110. Epub ahead of print. PMID: 36040453.

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