急性早幼粒细胞白血病（APL）以伴有t（15；17）易位形成的PML/RARA融合基因为主要特征，而PML/RARA融合基因通过影响髓系祖细胞的自我更新和分化能力来促进APL的发生。作为治疗APL的高效、高选择性药物，砷剂单药可治愈70%的患者。砷剂主要作用于PML/RARA融合基因的PML部分，通过与PML直接结合促进NB的形成、与类泛素修饰物（SUMO）结合，最终引起泛素化和PML/RARA融合蛋白的降解。目前，ATRA联合砷剂作为APL的一线治疗可治愈几乎所有的非高危APL患者，而35%～40%的携带FLT3-ITD突变的高危APL患者常伴有高白细胞、对ATRA不敏感等不良预后因素。研究表明砷剂治疗可改善FLT3-ITD APL患者的不良预后，但砷剂的作用机制和ATRA的耐药机制尚不明确。

在FVB/N和C57BI/6Nj小鼠的基础上，通过病毒转导、移植等实验方法构建了PML/RARA小鼠模型（P/R）和敲入了FLT3-ITD的PML/RARA小鼠模型（P/R-FLT3ki）。ATRA皮下给药控制在21天释放10mg pellets，1mg/mL的砷剂按5ug/g体重腹膜注射。

通过比较P/R-FLT3ki和P/R小鼠的生存曲线，可以发现P/R-FLT3ki并没有显著加速白血病的进展(图1A)，仅有病理结果显示在骨髓、脾脏中见到更多原始细胞的浸润。 

图1A  P/R-FLT3ki（蓝线）和P/R小鼠（红线）的生存预后分析

通过MGG染色和流式细胞术评估ATRA诱导的粒系分化（标记Gr1和CD11b），结果发现在ATRA应用2天后P/R APL已经出现明显分化，而P/R-FLT3ki APL在day 6才出现明显的分化特征。同时作者标记了作为白血病细胞自我更新标志的c-kit/CD117，发现P/R小鼠在第2天就出现了该标志的丢失，而P/R-FLT3ki中的c-kit表达持续到了应用ATRA后第6天。通过对比P/R和P/R-FLT3ki小鼠中的GFP阳性细胞可以评估APL细胞的清除（clearance）。作者观察到P/R APL在第6天时正常骨髓细胞（GFP-）已经开始取代白血病细胞（GFP+），在day 8时完全清除。而在P/R-FLT3ki小鼠中，第6天并未发生P/R APL中出现的白血病细胞清除现象，并且ATRA治疗自始至终从未完全清除P/R-FLT3ki APL细胞。此外，白血病细胞在第10天时出现死灰复燃（图2B）。以上结果说明FLT3-ITD突变阻碍了APL小鼠对ATRA的治疗反应。 

图2B 体内应用ATRA治疗后P/R-FLT3ki和P/R小鼠骨髓GFP阳性细胞的比例

为研究FLT3ki的ATRA耐药机制，作者在ATRA治疗P/R和P/R-FLT3ki小鼠的9h和24h内进行了转录组分析，发现PML/RARA主要的靶基因（如Pram1和Cyp26a1）仍然被大量激活，同时这两个模型激活的信号通路也非常相似，这说明敲入FLT3-ITD后，ATRA介导的转录作用并未受到影响。

作者首先比较了ATRA治疗P/R和P/R-FLT3ki两个模型中NB的状态。未治疗时，两者的人类PML蛋白和鼠PML蛋白（mPML）均表现为“微斑点”样（micropeckles）。其中在P/R-FLT3ki APL中，PML/RARA融合蛋白总是在胞浆中出现，和一些APL患者的情况类似。ATRA治疗后2天，P/R细胞中mPML重组为正常形态的NB，而P/R-FLT3ki的NB仍表现为微斑点样（图3B）。NB的重组失败可能解释ATRA耐药的原因。此外，先前有研究表明

p53是PML NB的一个关键下游效应器。结果也证实了这一点，ATRA治疗后P/R APL中p53通路激活了，而P/R-FLT3ki中则未见明显激活。 

图3B 免疫荧光示ATRA未治疗和治疗2天时PML NB的结构。鼠PML（绿色）；人PML/RARA融合蛋白（红色）；DAPI（蓝色）示细胞核染色

作者用western blot和免疫荧光进一步比较了两个APL模型中PML/RARA蛋白的降解情况。结果显示P/R APL中PML/RARA蛋白随着ATRA的治疗逐渐降解，而在P/R—FLT3ki APL中

PML/RARA蛋白的表达持续到了应用ATRA第6天。PML/RARA融合蛋白的低效降解最有可能解释耐药的原因（图4A）。 

图4A Western blots示ATRA治疗过程中P/R和P/R-FLT3ki骨髓PML/RARA蛋白的表达变化（Vinclin为内参蛋白）及对应GFP阳性细胞的估测比例

作者在P/R和P/R-FLT3ki两个模型中联合应用ATRA和砷剂评估疗效。在应用ATRA后第2天，

P/R和P/R-FLT3ki APL均出现了显著细胞分化。通过监测GFP阳性细胞，可以发现终末分化随后紧接着是APL细胞的大量清除，P/R-FLT3ki APL在day 6已经恢复正常造血。而c-kit的丢失，或许也可以解释砷剂促进了P/R-FLT3ki APL细胞的清除。此外，作者通过标记Annexin-V和Caspase-3检测细胞凋亡，发现P/R-FLT3ki在单用ATRA时并没有出现凋亡的增加，而砷剂的加入则明显诱导了P/R和P/R-FLT3ki APL细胞的凋亡。在P/R-FLT3ki 小鼠中，

图5B  ATRA联合砷剂治疗后P/R-FLT3ki和P/R小⿏骨髓GFP阳性细胞的⽐例

PML/RARA融合蛋白的降解也随着联合用药而加速（图 5D）。同样，在2个APL模型中PML NB也都在第2天早期恢复了正常结构。 

图5D Western blots示ATRA联合砷剂治疗P/R和P/R-FLT3ki骨髓PML/RARA蛋白的表达变化

该研究通过体内实验证实了敲入FLT3-ITD并不能加速APL的进展，只是明显抑制了ATRA的治疗反应。FLT3通过阻碍ATRA诱导的PML/RARA和RARA的降解，抑制了PML NB结构恢复和p53激活。同时，砷剂的加入可以逆转ATRA耐药带来的表型和功能。该研究首次通过体内实验解释了临床上伴有FLT3-ITD的APL患者单用ATRA治疗预后较差的原因，并提示砷剂应作为伴有FLT3-ITD的高危患者一线治疗使用（联合或不联合化疗）。