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EBV相关的肝内胆管癌的临床病理特征、肿瘤免疫微环境和基因组景观

NO.3

2021-10-22 来源 : VIP说

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肝内胆管癌（Intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC）是第二常见的肝脏恶性肿瘤，与西方相比，东方世界部分地区的发病率要高得多。近几十年来，ICC的发病率在全球范围内呈上升趋势，其病因和发病机制尚不完全清楚。因为其生物侵袭性、较差的可切除性以及目前有限的治疗方法，ICC患者生存率低。目前，大约50%的病例仍然没有任何可识别的危险因素去诊断。

EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）与多种呼吸道/消化道肿瘤有关，特别是未分化鼻咽癌（Undifferentialnasopharyngeal carcinoma，NPC）和EBV相关胃癌（EBVaGC），但EBV感染与ICC发病的关系尚不清楚。

目前关于EBV相关ICC(EBVaICC)的证据水平仅基于病例报告和小本报道。值得注意的是，以前报告的绝大多数EBVaICC病例发生在亚洲，具有中国血统，显示出显著的种族和地理分布特性。到目前为止，对EBVaICC知之甚少，合适的治疗方案仍然未知。因此，需要系统和深入的了解，以进一步阐明这一罕见的实体瘤，并提供对于发病机制和治疗策略有价值的见解。

因此，研究者旨在全面调查中国南方临床病理特征，肿瘤免疫微环境(TIME)和基因组景观。采用EBV原位杂交技术对303例ICCs进行检测，比较EBVaICC与nonEBVaICC的临床病理参数，并采用免疫组化，双重染色，巢式PCR，多重免疫荧光染色，荧光原位杂交和全外显子组测序等方法分析EBV感染情况，肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）和EBVaICC的基因组特征。

并首次报道了一例生存期长达84个月的EBVaICC患者，该患者对包括ICIs在内的综合治疗显示出显著的应答。此外，还首次揭示了来自该肿瘤的EBVaICC和EBV的基因组景观。

Highlights：

EBVaICC占ICCs的6.6%，以EBV潜伏I型和克隆型EBV分离株形式。
EBVaICC具有独特的病因学，临床病理学和分子遗传学特征。
在EBVaICC中，肿瘤浸润淋巴细胞中PD-1和PD-L1以及肿瘤细胞中PD-L1均过表达。
大多数EBVaICC属于TMIT I型，矛盾的是，患者对ICIs可能呈现良好的应答
EBVaICC的LEL亚型与良好的生存率有关，可能与肿瘤浸润的B细胞和CD8+T细胞免疫激活有关。

该研究属于回顾性研究，纳入了303例ICC患者，这些患者于2008年4月至2017年5月期间在中国广州中山大学肿瘤中心进行了首次手术切除。存活患者的中位随访期为50个月。

在原发性ICCs中检测到6.6%（20/303）患者具有EBERs表达，而在其他类型的ICCs中均未观察到EBERs，如肝门周围胆管癌（pCCA），远端胆管癌（dCCA），混合性肝细胞和胆管癌（cHCC-CCA）和肝细胞癌(HCC)。通过双重染色显示仅在EBVaICC肿瘤细胞中检测到EBV，而所有EBVaICCs对EBNA1呈阳性，但对LMP1和EBNA2呈阴性，这表明EBV属于潜伏I型感染。并通过巢式PCR在所有20个EBVaICC中检测出克隆性EBV分离株。

EBVaICC患者年龄24～68岁，中位年龄46.5岁。女性占优势，男女比例为1:3。所有患者均为中国人。10例患者（50%）显示HBsAg血清反应阳性，仅1例患者（5%）有组织学证实的肝硬化。19例（95%）患者存在孤立性肿瘤。根据AJCC TNM分期（第8版），14例（70%）患者分为I/II期，6例（30%）患者分为III/IV期。15例可用病例中有2例（13.3%）血清EBV DNA>1000拷贝/毫升。

EBVaICC的病理资料，包括组织学，免疫组化和原位杂交。组织学上，淋巴上皮瘤样(LEL)亚型和常规型(CT)ICC在EBVaICC中分别占比45%（9/20）和55%（11/20）。在所有LEL亚型EBVaICC的病例中肿瘤内均发现次级淋巴滤泡，但在任何EBVaICC CTs中均未发现次级淋巴滤泡。所有EBVaICC显示胆汁型细胞角蛋白(CK7和CK19)的可变表达，并且显示微卫星不稳定性错义修复蛋白(MLH1，PMS2，MSH2和MSH6)的免疫阳性。

除HBV外，EBV感染与ICC的任何已知危险因素均无显著相关。与nonEBVaICC患者相比，EBVaICC主要发生于女性（75.0%对37.8%），年轻患者（中位年龄46.5对57.0岁），HBsAg阳性率较高（50.0%对26.1%），肝硬化背景较低（5.0%对27.2%），胆石症/胆总管结石率较低（0%对16.8%），孤立肿瘤（95.0%对70.7%）和血清CA19-9水平较低（30.0%对58.0%）（p值均<0.05)。组织学上，ICC的LEL亚型在EBVaICC中显著高于nonEBVaICC（45%对0.7%，P<0.001)，表明LEL亚型与EBV感染有密切关系。

尽管EBV感染与ICC中OS和RFS无显著相关，但EBVaICC（LEL亚型）的2年OS率（89%）明显优于EBVaICC(CT)(36%)和nonEBVaICC(38%)(P=0.028)。EBVaICC（LEL亚型）的2年RFS率为67%，高于EBVaICC(CT)和nonEBVaICC的分别为27%和30%(P=0.074)，但无显著差异。值得注意的是，EBVaICC的2年OS和RFS率明显优于HBVaICC和LFaICC。

EBVaICC TIL以CD3+T细胞 (84.4%±3.6%)，CD20+B细胞 (9.4%±2.8%)和CD68+TAM(6.1%±1.1%)为主。在T细胞群中，CD8+T细胞占71.4%±2.9%，Foxp3+T细胞占15.0%±2.0%，CTLA-4+T细胞占13.6%±1.9%。在EBVaICC中，HLA-DR+M1 TAM(77.6%±2.9%)明显高于CD163+M2 TAMs (22.4%±2.9%)。与nonEBVaICC相比，EBVaICC中CD20+B细胞和CD8+T细胞群体的比例显著增加，而M1/M2 TAMs比例没有发现差异。

与nonEBVaICC相比，EBVaICC中肿瘤浸润免疫细胞的密度显著增加，包括CD20+B细胞，CD3+T细胞，CD68+TAM，CD8+T细胞，FOXP3+T细胞，CTLA-4+T细胞，HLA-DR+M1 TAM和CD163+M2 TAM（所有p值均<0.01)。值得注意的是，EBVaICC的肿瘤免疫微环境明显比HBVaICC和LFaICC更丰富。

与EBVaICC CT和nonEBVaICC比较，EBVaICC LEL亚型具有明显高密度的CD20+B细胞，CD3+T细胞和CD8+T细胞（P均<0.05)。值得注意的是，CD20+B细胞和CD8+T细胞密度的增加分别与ICC中较长的OS和RFS显著相关（所有比较均P<0.05)

EBVaICC中显著过表达PD-L1-TIL，PD-L1-Tumor和PD-1-TIL。95.0%（19/20）EBVaICCs的肿瘤PDL1阳性（IRS评分≥3)，而仅22.3%（63/283）nonEBVaICCs 的肿瘤PDL1阳性（IRS评分≥3) (P<0.0001)；PDL1-TILs在EBVaICCs中的阳性率为100%（20/20）（IRS评分≥1)，而在nonEBVaICCs中的阳性率仅为56.5%（160/283）（P<0.0001）。

共有95.0%（19/20）的EBVaICCs的PD1-TILs阳性（IRS评分≥1)，而nonEBVaICCs的PD1-TILs阳性率仅为64.0%（181/283）(P=0.005)。有趣的是，通过FISH分析，95%（19/20）的EBVaICCs中未观察到PD-L1基因扩增。

研究者根据免疫组化将每个ICC样本分为TMIT四种类型（Ⅰ型(PD-L1+/CD8-high），Ⅱ型(PD-L1-/CD8-low），Ⅲ型(PD-L1+/CD8-low）和Ⅳ型(PD-L1-/CD8-high）。结果：Ⅰ型53例（17.5%）；Ⅱ型123例（40.6%）；Ⅲ型29例（9.6%）；Ⅳ型98例（32.3%）。TMIT与ICC中OS显著相关(P=0.014)，但对于RFS不显著(P=0.059)。

TMIT I亚组生存获益最好，TMIT III亚组生存获益最差。值得注意的是，EBVaICC与TMIT I显著相关，因为90%（18/20）的EBVaICC属于TMIT I，而nonEBVaICC仅为12.4%（35/283）(P<0.0001)。来自病例4号的患者对包括ICIs治疗在内的联合治疗显示出显著的反应，生存期长至84个月。有趣的是，与HBVaICC和LFaICC相比，EBVaICC具有显著不同的TMIT（除了具有显著升高的TIL和具有高的PD-L1表达之外）。

研究者进一步分析了10个平均复盖率为100×的EBVaICCs的WES数据，鉴定出3353个体细胞同义和非同义突变（包括单核苷酸突变和小插入和缺失，或InDels）。体细胞突变包括1346个非沉默突变和2007个沉默突变，这揭示了高突变率（中位数:每兆酶4.4个突变）。我们发现7个基因是至少在三个患者中受到非沉默突变的影响，包括MUC4，DNAH1，GLI2，LIPE，MYH7，RP11-766F14.2和WDR36。

体细胞突变类型以C:G>T:A和C:G>A:T为主。然后，鉴定出三个独立且稳定的突变标记。另外，用MuSigCV软件预测了22个潜在的EBVaICC的驱动基因。值得注意的是，EBVaICC显示出与其它EBV相关癌包括EBVaGC，NPC和肺淋巴上皮瘤样癌(LELC)和其它感染相关CCA（包括HBVaICC和LFaCCA不同的突变模式。

当分析具有从药物基因相互作用数据库汇编的信息的Maftools中的可用药基因组的突变时，在三个病例（30%）中鉴定出PRSS1的缺失，PRSS1被认为是胰腺炎中的疾病原因。CD274的扩增与EBVAGC中PD-L1的表达增高有关，而CD274的扩增与EBVaGC中PD-L1的表达增高有关。用novoBreak算法检测10例EBVaICC中用分离双色探针进行FISH分析未发现FGFR2基因融合。

在ICC衍生的EBV中发现的前40个常见非同义突变。所有病例均有BKRF4(H171N)，BcRF1(T33A)，BKRF4(G169V)，BOLF1(D1154E)和BPLF1(S405G)等新的热点，除BPLF1(S405G)因GC DNA模板过高而导致突变验证失败外，其余的热点均在肿瘤组织中被成功验证。

值得注意的是，BOLF1和BRRF2的变异在ICC中显著富集，而在EBNAs，LMP1，LMP2和BDLF2/3上的变异除外，这些变异在来源于其它癌症的EBV中一致报道。

然而，这项研究在某些方面是有限的。虽然纳入了大量的ICC队列，但EBVaICC和对照组（pCCA，dCCA和cHCC-CCA）的数量仍然较少，部分结果可能需要验证。

此外，由于新鲜组织标本中RNA质量较差，整个转录组测序失败。此外，根据我们的WES数据，没有观察到EBV基因组整合的可靠证据。未进行全基因组测序，EBV是否直接整合到宿主基因组中仍是未知的。

EBVaICC占ICCs的6.6%，以EBV潜伏I型和克隆性EBV分离株形式。EBVaICC的独特临床病理特征如下：女性多见及年轻患者多见，孤立性肿瘤，具有较高HBV感染率，少有肝硬化背景，增高的淋巴上皮瘤样(LEL)亚型比例。

EBVaICC的肿瘤免疫微环境比nonEBVaICC更丰富。EBVaICC LEL亚型中CD20+B细胞和CD8+T细胞密度和比例明显增高，与EBVaICC常规型和nonEBVaICC相比，LEL亚型与2年OS和RFS显著相关。TIL中PD-1和PD-L1及肿瘤细胞中PD-L1在EBVaICC中均过表达。肿瘤环境免疫类型I型(TMIT) (PD-L1-Tumor+/CD8-high)在EBVaICC中明显高于nonEBVaICC。在至少三个病例中发现了突变基因，包括MUC4，DNAH1，GLI2，LIPE，MYH7，RP11-766F14.2和WDR36。EBVaICC与已报道的肝吸虫相关胆管癌和HBVaICC相比具有不同的突变模式。

结论：ICC的亚分类EBVaICC具有独特的病理学特征、临床病理学特征和显著增加的肿瘤免疫微环境的分子遗传学特征。大多数病例属于TMIT I型。但自相矛盾的是，EBVaICC患者可能是免疫治疗的候选者。

参考文献

1. J Hepatol . 2020 Nov 16;S0168-8278(20)33763-6