前言

最近Nature Reviews Genetics杂志刊发了埃默里大学James E. Dahlman教授关于RNA药物非病毒递送载体的综述，回顾了RNA递送载体的种类、作用机制以及设计和开发的考量，并总结了成功RNA递送载体的六大特征和提高开发效率的策略。   

作者 |  betaloc

RNA药物通过识别与其互补的序列来靶向相应的基因转录和翻译过程，从而抑制特定蛋白的表达，最终起到治疗疾病的作用。相比传统小分子和抗体药物，RNA药物直接在基因水平发挥调控作用，对致病基因清晰而相关蛋白质难以成药的靶点具有独特优势，在肿瘤、免疫疾病、罕见遗传病等领域有极大的应用潜力。

RNA药物靶点

RNA药物根据分子量的大小分为两类，一类是分子量较小的小干扰RNA(siRNA)、反义寡核苷酸(ASO)和能够招募腺苷脱氨酶的寡核苷酸，这类RNA药物一般序列较短，分子量在数千至数万道尔顿，可通过化学制备合成，使用细胞中已有的酶来行使它们的功能。

分子量较小的RNA药物

另一类是分子量较大的mRNA，在细胞内可直接翻译成相应的目标蛋白，比如基因编辑相关的CRISPR蛋白、新冠病毒S蛋白、示踪的绿色荧光蛋白等。mRNA序列较长，分子量在几十万至几百万道尔顿，目前主要在体外转录得到，还不能化学合成。

分子量较大的mRNA药物

据不完全统计，目前已有至少14款RNA药物获得监管机构批准，除两款新冠疫苗外，主要用于遗传性罕见病的治疗，开发公司均为中小型的Biotech。

获批的RNA药物

RNA药物分子量大，并且带有负电荷，不易透过生物膜到达作用部位，此外，血液和组织中存在着许多的RNA内切酶，容易将治疗性的RNA降解。因此，科学家们开发了RNA递送系统，来保护RNA并提升其靶向能力，目前主要有基于脂质的和基于聚合物的两种纳米载体递送系统。

基于脂质的纳米载体递送系统(Lipids and lipid-based nanoparticles, LNPs)是发展最快的一类药物递送系统，配方简单、生物相容性好、生物利用度高、有效载荷大，目前已被FDA批准用于mRNA和siRNA的递送，其形式主要有胶束、脂质体和脂质纳米粒三种。

LNPs包含4种基本成分：胆固醇、辅助脂质、PEG修饰脂质和带有氨基的阳离子或可电离脂质。其中阳离子脂质可与带负电的RNA吸附结合，胆固醇可以稳定纳米粒的空间结构，辅助脂质则可以加快LNP在细胞中的结构变化，加速RNA的释放，PEG-脂质因为PEG的修饰，可以提高LNP的整体稳定性，延长其在血浆中的半衰期，以使更多的RNA药物富集到靶组织。

LNP到达细胞膜时，阳离子磷脂与带负电荷的细胞膜发生膜融合，细胞膜去稳定化，LNP内化形成胞内体(Endosome)。胞内体的酸性环境使电离脂质的头部质子化并带正电荷，从而与胞内体的内膜融合，将RNA释放到细胞中发挥作用。

对LNP组分进行化学修饰和比例调整可以改善LNP的功能。比如Michael等在DLinDMA脂质头部引入烷氧基，使得RNA递送效率大大提高，小鼠体内给药剂量降低了500倍；Kevin等用化学修饰的胆固醇代替DSPC则促进了LNP向脾脏和肺的递送。

LNP递送原理

 LNP递送系统组分

基于聚合物的纳米递送系统(Polymer-based nanoparticles)是相对创新的一种递送方式，以树枝状大分子、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)等高分子聚合物为载体，将RNA包裹其中进行递送，具有生物可降解性、生物相容性、较高的水溶性、贮存稳定等物理化学性质，被认为是理想的药物递送材料。

聚合物纳米颗粒的递送原理与LNP类似，经细胞膜内化形成胞内体以后在酸性条件下释放出治疗性的RNA。目前研究较多的材料包括PLGA、聚乙烯亚胺(PEI)、聚(β-氨基酯) (PBAE)、聚(酰胺基胺)(PAMAM)等，其中PLGA已被 FDA 批准用于递送小分子药物。这些聚合物材料同样均含有带正电荷的胺基，可以吸附结合带负电的RNA。对他们进行化学修饰也可以改善他们的功能，比如对树枝状大分子进行PEG化，可以降低其免疫原性并提高转染能力，在其表面修饰靶向配体则可实现对肿瘤组织的特异性递送；对聚合物胶束进行多聚赖氨酸修饰则可以提高其中枢神经系统靶向性。

聚合物纳米递送系统组分

目前RNA递送系统的靶向策略分为被动靶向和主动靶向两种，被动靶向是指通过调控纳米颗粒的尺寸、形貌、结构、表面性质等理化性质，使其不依赖于靶向分子的识别能力就能进入特定细胞器、细胞、组织或器官。比表面积很高的纳米粒在血液循环中会结合环境中的生化分子(比如血浆脂蛋白ApoE)，而ApoE可以被肝细胞上的低密度脂蛋白受体(LDLR)识别，从而实现纳米颗粒对肝组织的被动靶向；而通过调节纳米粒的电荷负载量，则可以实现对脾脏的被动靶向；通过调节纳米粒的粒径大小，使其粒径小于肝窦状隙内皮细胞孔隙，则可实现对肝组织的靶向递送。

LNP的被动靶向

主动靶向是指纳米颗粒通过其表面修饰的靶向分子的识别能力进入特定细胞器、细胞、组织或器官。目前经过临床验证的一个例子是GalNAc修饰的肝主动靶向，Givosiran、Lumasiran和Inclisiran都采用了这种策略。N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)是肝细胞表面特异性表达的去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)的配体， GalNAc和ASGPR结合后迅速引起内吞，然后可以迅速回收，重新回到细胞表面，Givosiran等通过偶联GalNAc，显著提升了其治疗的安全性。此外，也可将具有靶向作用的抗体直接与小分子量的RNA偶联，以实现RNA的靶向递送。比如，使用CD71抗体可以将siRNA递送到心肌和骨骼肌中，并实现长时间的基因沉默，目前已有基于该策略的siRNA药物进入治疗肌强直性营养不良的I/II期临床试验。mRNA的分子量太大，因此它们的主动靶向递送策略主要依靠在其纳米颗粒载体表面修饰抗体或靶向小分子。

RNA药物的主动靶向

RNA递送载体的开发与小分子药物的开发有着类似的地方，均有一个大规模筛选的过程。首先是基于细胞系的高通量筛选，可能需要检验上千种纳米颗粒，然后一小部分被选出进行小鼠实验，更少的一部分被选出进行非人灵长类动物实验，只有在非人灵长类实验中表现出足够安全性，才有可能进入临床开发阶段。

RNA递送载体的开发流程

由于递送载体在细胞实验的结果并不能很好的预测动物或人体内的递送情况，而进行上千只的小鼠实验又是不可行的，所以科学家们开发了DNA条形码系统，让在动物体内同时检测上千种纳米颗粒成为可能。即通过不同的DNA片段对不同的LNP进行标记，并将这些LNP一起注射到小鼠体内，然后收集靶标组织或细胞，分离检测DNA条形码的水平，就可量化特定LNP的递送效率。此外，寻找合适的动物模型也是提高递送载体开发效率的重要方式，因为物种的不同可导致基础代谢率、血浆脂质水平以及器官重量占比等差异，从而影响纳米载体粒的胶体稳定性、分布、毒性、清除率以及和细胞的相互作用。

成功RNA递送载体特征

结论

作者根据FDA已经批准的RNA药物递送系统，总结了成功应用于临床的RNA递送载体的六个特征，以供借鉴：

◆ 载体材料可被生物降解，化学合成可拓展。比如，在可电离脂质中引入酯键可以改善LNP的安全性。

◆ 化学合成途径足够简单，可以大规模生产以供临床使用。

◆ 靶向递送和脱靶递送的RNA比例可接受。

◆ 疗效剂量必须显著低于最低毒性剂量。

◆ 递送效率稳定可重复，不同批次药物药效保持一致。

◆ 重复给药不会导致疗效或安全性的丧失。

参考文献：  

[1] Paunovska, K., Loughrey, D. & Dahlman, J.E. Drug delivery systems for RNA therapeutics. Nat Rev Genet 23, 265–280 (2022). 

[2] Guevara ML, Persano F, Persano S. Advances in Lipid Nanoparticles for mRNA-Based Cancer Immunotherapy. Front Chem. 23;8:589959 (2020). 

[3] Hou, X., Zaks, T., Langer, R. et al. Lipid nanoparticles for mRNA delivery. Nat Rev Mater 6, 1078–1094 (2021). 

[4] Swingle KL, Hamilton AG, Mitchell MJ. Lipid Nanoparticle-Mediated Delivery of mRNA Therapeutics and Vaccines. Trends Mol Med. 27(6):616-617(2021). 

[5] Mitchell, M.J., Billingsley, M.M., Haley, R.M. et al. Engineering precision nanoparticles for drug delivery. Nat Rev Drug Discov 20, 101–124 (2021). [6] https://citeline.informa.com/

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