金氏菌属（Kingella kingae）通常在人口咽部无症状定植，是新发现的一种引起小儿骨关节炎、脓毒性菌血症、感染性心内膜炎、脑膜炎等侵袭性疾病的重要的新发现的病原体，通过密切接触传播，主要侵犯2~4岁婴幼儿。本文简要的概述了金氏菌属的分类及其实验室诊断新技术，对金氏菌病早期确诊和给予有效的抗菌治疗，预防晚期后遗症、保护儿童健康成长具有重要意义。

基本属性

金氏菌属（Kingella）隶属于β-变形菌纲（β-Proteobacteria），奈瑟氏菌科（Neisseriaceae），DNA基因组大小为1,990,794 bp和2,096,758 bp，蛋白编码基因1,981 ~2,300，G+C含量 46.8% ~ 46.9mol%，模式菌为金氏金氏菌（Kingella kingae）。

目前已确认的4个金氏菌种：金氏金氏菌（K. kingae）是引起人类疾病最常见的病因，主要导致儿童人群中的骨关节感染和菌血症；反硝化金氏菌（K. denitrificans），是引起菌血症、心内膜炎、胸膜脓胸、儿童阴道炎、羊膜绒毛膜炎和艾滋病患者肉芽肿性疾病的重要病原；口金氏菌（K. oralis）寄居在人类颊腔，与牙菌斑和牙周炎有关；蜜熊金氏菌（K. potus）从被蜜熊咬伤感染者的伤口分泌物中分离，是一种人畜共患病菌。

根据对金氏菌属的生化特征和脂肪酸组成，以及基因型研究分析，金氏菌属是一个独立的物种，与其他奈瑟氏菌科（Neisseriaceae）亲缘关系较远。

实验室诊断

01 细菌培养

金氏菌（K. kingae）是一种兼性厌氧菌，在传统血琼脂培养基、巧克力琼脂、哥伦比亚血琼脂等培养基上生长，但不能在MacConkey或Krigler琼脂上生长，含5%CO2环境中生长良好。

在固体培养基上生长的特点是琼脂表面有明显的凹坑，产生3种与菌毛表达程度相关的菌落类型：一种蔓延的腐蚀形态，其特征是被宽边缘包围的中央小菌落；非蔓延/非腐蚀类型，包括被窄边缘包围的扁平菌落和没有明显边缘的圆顶状菌落。前两种形态与长伞的存在有关，而半球形菌落生长的菌株是无毛的，在反复传代培养后，产生扩散腐蚀型形态的能力会不可逆转地丧失。

02 细菌分离培养

将滑膜液样品接种到Bactec、BacT/Alert、Hémoline DUO、Isolator 1.5 Microbial Tube和自制液体培养基（in-house-made liquid media）等商业系统的需氧BCVs中，可显著提高培养的敏感性。

咽喉标本分离培养金氏菌， 由于其定殖菌群异常复杂性和高浓度，分离培养金氏菌比较困难。因此，在BAV培养基中添加2µg/mL万古霉素，通过抑制G+菌群，用于β-溶血性金氏菌（beta-hemolytic K. kingae）鉴定。结果，应用添加2µg/mL万古霉素BAV平板在44例口咽培养中43例（97.7%）检出金氏菌，而在普通血琼脂的培养皿中仅有10例（22.7%）检出金氏菌（p<0.001）。

咽拭子标本应置Amies或类似的输送培养基中保存，并及时送到实验室处置。

03 生化鉴定

金氏菌生化反应：氧化酶+，触媒-，麦凯康生长-，西蒙氏枸橼酸盐-，硝酸盐还原不定，精氨酸双水解酶-，苯基丙氨酸脱氨酶-/±，脲酶-，产吲哚-，甘露醇产酸-，葡萄糖产酸 +。金氏菌生化反应鉴定见表2。 

表2  金氏菌与杆状奈瑟氏菌的鉴别

04 分子测定法

由于儿童脓毒性关节炎、骨髓炎潜在严重的并发症和长期功能障碍的风险，对于早期确诊和给予有效的抗菌治疗，预防晚期后遗症、甚至死亡至关重要。采用常规细菌分离培养、鉴定至少需要2~3d。近年来，使用NAA（Nucleic Acid Amplification）核酸扩增技术，可在24h内确定关节和骨骼感染的病因。

（1）RT-PCR法：  宋杨等报告，基于金氏菌16S rDNA、groEL基因和特殊毒力基因rtxA建立RT-PCR 检测法，可显著提高金氏菌临床诊断水平。 

（2）试验菌株及序列：  参考菌株金氏金氏菌ATCC 23330，脑膜炎奈瑟氏菌 CMCC 29060、肺炎链球菌49619、流感嗜血杆菌M5216、百日咳鲍特菌 ATCC 9797、金黄色葡萄球菌ATCC 25923、大肠埃希菌ATCC 25922、嗜肺军团菌ATCC 33152。

（3）引物和探针：  采用rtxA 基因设计引物和探针：  rtxA-F  ：5′-GCGCACAAGCAGGTGTACAA-3′；rtxA-R：5′-ACCTGCTGCTACTGTACCTGTTTTAG-3′；rtxAP*：5′-TTGAACAAAGCTGGACACG-3′。 

（4）DNA模板制备：  采用Promega试剂盒制备待检菌株DNA模板，咽拭子标本用600μL无菌PBS缓冲液洗脱，12000 r/min离心5min，弃上清，参照 Promega DNA提取试剂盒说明书提取DNA。 

（5）RT-PCR程序：  反应体系总容积20μL，含10 Μl 2×Taq Mastermix，正、反向引物及探针各2μL，模板2μL，dd H2O1.6 μL; PCR反应：95 ℃ 30s→95℃ 5s→60 ℃ 30s，50个循环。经过PCR扩增后对其产物进行测序，并与特异性序列rtxA进行比对分析，构建亲缘关系进化树。结果46株金氏菌rtxA、16S rDNA、groEL 基因与其他参比序列进行同源性分析，完全吻合。 

（6）临床标本RT-PCR检测：  宋杨等应用本法对我国新疆地区  （伊宁和阿克苏市）  采集健康人群咽拭子标本513份，其中男性219例，女性294例，年龄最小2月龄，最大53岁。513份标本中共检出107份金氏金氏菌阳性，总阳性率20.86%。各年龄组均检出金氏金氏菌阳性标本，以6～10岁组阳性率最高，分别为20.59%和57.78%。检测金氏菌RTX毒素编码基因  （rtxA和/或rtx  B）  ，其敏感性可检出30 CFU金氏菌，并且具有很高的特异性，适用于各种临床标本检测。

05 mdh基因鉴定

El Houmami等报告，为了提高金氏菌groEL和rtx靶基因检测的特异性和敏感性，针对金氏菌苹果酸脱氢酶（K. kingae malate dehydrogenase）Kkimdh基因，设计引物和探针，新建了一种检测金氏菌Kkimdh基因的RT-PCR，用于检测20种不同序列类型的金氏菌苹果酸脱氢酶（mdh）基因和18种金氏菌mdh基因的变种。该方法具有较高的特异性和敏感性，用于临床检测了104例7个月至7岁儿童的金氏菌感染者和携带者。

06 引物和探针

针对45株金氏菌（K. kingae）mdh核苷酸序列，设计引物：Fwd-Kkimdh：5'-TGTTCCGCATTGCTTCTG-3'和Rev-Kkimdh：5'-TCATGC CGTCCAACAATG-3 '，扩增144 bp片段；探针P-Kkimdh：5'-FAM-CATCAT CACGCCCTGAACGGCTT-3'。避免了对所有金氏菌菌株之间的核苷酸错配，并最大限度地阻止与从其他细菌种检测到的mdh同源株进行错配。

07 PCR程序

Kkimdh RT-PCR反应混合液（Takyon No Rox Probe Master Mix dTTP，Eurogentec）10μL、引物0.45μmol/L（各）、标记探针0.45μmol/L、纯化DNA5μL，总体积20μL，进行RT-PCR扩增反应；使用Bio-Rad CFX96扩增仪，循环参数如下：50°C 2min→95°C 3min→[95°C 3s→60°C 30s]×45个循环。

金氏菌产生的RTX毒素是一种强效细胞毒素，对人类多种细胞有毒，在诱导呼吸道上皮细胞、滑膜细胞和巨噬细胞样细胞毒性方面具有重要作用。以RTX毒素基因为靶点的PCR检测法，在临床病例实际应用中，其灵敏度为30CFU，比半巢式PCR检测16S rRNA基因灵敏度高10倍，与其他引起骨关节感染相关的几种病原体无交叉反应。

08 半巢式广谱-PCR（semi-nested broad-range PCR）

Cherkaoui等报告采用RT-PCR和半巢式广谱-PCR检测金氏菌rtxA、rtxB和16S rRNA基因。

（1）试验菌株：将脓毒性关节炎和骨髓炎患者分离的金氏菌株接种在哥伦比亚血琼脂和巧克力琼脂，于37℃ 5% CO2孵育生长。 

（2）DNA提取和纯化：将金氏菌株、骨关节液和滑膜活检组织在55℃条件下与蛋白酶K和裂解缓冲液孵育1h，使用MagNAPure LC DNA分离试剂盒II  （罗氏公司） 提取DNA，溶于100µL洗脱液中。每次PCR分析取5µL DNA提取物。 

（3）引物和探针：根据金氏菌广谱16S rRNA基因  （broad-range 16S rRNA gene）  设计PCR引物和探针，见表3。 表3  金氏金氏菌扩增rtxA，rtxB和16S rRNA基因引物和探针

（4）扩增程序：广谱PCR扩增16S rRNA，第一轮扩增使用30 pmol/L引物BAK11w和BAK2：预变性95℃ 10min→[95℃ 20s→48℃ 45s→72℃ 1 min] × 40个循环。取第一轮扩增产物5µL，引物BAK11w和BAK533r进行半巢式PCR扩增，方法与第1轮扩增相似，但周期为：[95℃ 20s→50℃ 45s→72℃ 1min]× 40个循环。PCR阳性金氏菌样品作为阳性对照，用于DNA提取试剂的混合物作为阴性对照。扩增产物在2% EDTA琼脂糖凝胶上电泳，用溴化乙啶  （ethidium bromid）  染色，紫外检测仪观察结果，每次PCR分析都要重复进行。 

（5）16S rRNA基因测序：对BAK11w引物扩增子进行纯化和测序，片段分析使用自动DNA测序仪  （ABI PRISM 3130xl遗传分析仪；应用生物系统公司）  。

使用广谱PCR检测金氏菌固有的RTX毒素编码的rtxA / rtxB基因的敏感度为30 CFU金氏菌，比PCR检测16s rRNA基因或cpn60基因更敏感，可应用于临床检测金氏菌感染患者的关节分泌物，血液、滑膜液、活检组织以及上呼吸道标本中的金氏菌，与其他感染类似的病原菌没有发现交叉反应，而显示良好的特异性。