导言  

2021年12月29日，David N. Philpott等人在American Chemical Society（美国化学会）上发表了题目为“Rapid On-Cell Selection of High-Performance Human Antibodies ”的文章，该研究为了解决传统的噬菌体展示技术仍然存在的耗费时间和高失败率等问题，开发了新型噬菌体展示平台，该技术平台使用细胞表面呈递的抗原进行抗体的筛选，利用微流控平台(MICS)来控制结合动力学进行细胞-噬菌体分选，通过下一代测序（NGS）对分选产物测序，使用无监督的机器学习算法分析所有的抗体序列，预测抗体亲和力的结合趋势，并通过生物信息学分析来选择候选克隆进行验证，这种方法被称为μCellect，具有低成本、高通量，可以兼容多种细胞类型等优点，可以应用到抗体开发之中。

背景介绍 

噬菌体展示技术是一种被广泛使用的抗体发现技术，在抗体发现过程中，噬菌体抗体库的筛选是最为关键的环节之一，将文库内的噬菌体与靶标孵育，清除未结合的噬菌体，扩增结合的噬菌体，得到具有亲和力和特异性的克隆组成的亚库，再从中筛选单个克隆，并转化为IgG形式，用于诊断或治疗试剂。

目前广泛使用的筛选方法有很多，但是传统的筛选技术也存在着很多局限性，例如筛选周期长，筛选得到的抗体特异性以及亲和力不够高等问题。 针对这些问题，David N. Philpott等人提出了μCellect方法，该方法使用的是一种低成本（<50美元/芯片）、高通量(>107cells/h)的细胞分选器（MICS)，原始噬菌体文库与少数表达目标抗原的细胞和大量缺乏目标抗原的细胞共同孵育后，用捕获探针所特有的磁性纳米颗粒(MNPs)标记目标细胞，目标细胞通过一组倾斜的导向器进行横向偏转，以平衡Stokes的阻力（来自流体流动）和磁力（来自MNPs）（图1B)。继而开始进行分选。洗脱目标细胞得到噬菌体，并扩增得到噬菌体亚库，重复这个过程进行迭代富集，并且将所有的子库进行NGS测序(图1A)。为验证该方法的适用性，本文介绍了以针对Wnt信号通路中的关键配体人Frizzled-7的抗体筛选的过程以及结果。 

图 1. μCellect发现抗体流程和MICS设备分选细胞原理示意图

1、微流控细胞分选（MICS)平台试验

该试验使用带有GFP内部的外源性myc标签以区分共表达人Fzd7的目标细胞和阴性细胞，使用MICS设备分选之后，发现超过90%的myc+细胞被捕获，结果表明噬菌体结合对细胞捕获的影响最小(图2A)，之后，为了检测可在MICS装置上分辨出阳性细胞和阴性细胞的比例，将目标细胞加入到非抗原表达的细胞中，并对样本进行标记和分类，发现在靶细胞与非靶细胞的比例为1：200时，细胞几乎都被回收了，通过比较不同比例下细胞的分选效果，因此选择了1：20的比例来进行筛选(图2B)。最后，使用与噬菌体展示应用程序相关的指标，将MICS平台的性能与其他技术进行了对比测试。发现磁激活细胞分选(MACS)具有与MICS相当的通量，但结合的噬菌体在分选过程中会丢失，荧光激活细胞分选(FACS)具有与MICS相似的噬菌体回收率，但处理大细胞群时的速度很缓慢(图2C)。

图 2. 微流控分选技术的优化

2、生物淘选

使用Fzd7+myc+靶细胞对噬菌体文库进行两轮筛选，随后以myc+细胞为靶细胞进行负筛，去除与myc标签结合的克隆。该实验使用的文库是一个合成的人Fab文库，在6个互补性决定区(CDRs)中的4个可变区(L3、H1、H2和H3)中包含1013个独特的突变序列。CDR序列位于抗体可变区的最末端，是表位识别的关键因素。每轮，包含Fzd7+myc+细胞（2×106cells）与不含Fzd7的CHO细胞（4×107cells）的混合质粒使用优化的流速和并行运行两个MICS芯片，达到了6×107cells/h的吞吐量。富集的出口群体显示GFP的表达增加了8倍.这一数据表明，该设备具有高度的选择性。每轮试验完成后，从所有噬菌体中提取gDNA并用barcoded PCR扩增含CDR的区域，最后对样本进行汇总和深度测序。

3、数据分析和克隆的选择

通过对来自NGS的数据进行分析，得到每个克隆的富集分数，去除因为myc标签而富集的907克隆后，最终在第2轮留下了24350个独特的克隆。该文还开发了一种无监督的k-means方法来进行克隆的选择(图3A)。比较不同的K值可计算出群富集得分，最后得到最具有代表性的核心序列，当使用k=20进行分类时，发现L3比传统的H3亲和力更高。H1和H2的特异性较差(图3B)。当在对数据的多群类分析进行k值归一化时，绘制富集评分，富集评分高的克隆ML7、ML8和ML9也就是我们选中的克隆(图3C)。

图 3. 无监督的K-means

4、克隆的验证

将筛选获得的候选CDR序列还原为IgG1形式，并进行表达、纯化和定量。评估候选克隆结合Fzd7+myc+和myc+细胞的能力。同时将野生型CHO细胞作为非特异性结合的对照。采用OMP18R5(IgG2形式)作为阳性对照。结果显示三种候选克隆(ML7、ML8和ML9)对Fzd7+myc+靶细胞系表现出高特异的亲和力。其他候选克隆对靶细胞系的亲和力低(图4A)。结果表明，k-means算法得分高低比分群大小更能决定候选克隆的亲和力。对ML7、ML8和ML9进行的分析显示，ML9的EC50值和对Fzd7的解离常数(Kd)都与OMP18R5相当，且ML7、ML8和ML9对Fzd7的亲和力均在皮摩尔范围内(ML7,448±53pM；ML8,4.98±0.28nM；ML9,292±66pM；OMP18R5,236±50pM)(图4B,4C)。为了检测候选克隆是否能结合到内源性的人Fzd7细胞，我们以Fzd7的CRISPRKO的HEK293T细胞系作为阴性细胞对照。对一组Fzd7低表达的人细胞系进行了流式细胞术(图4D)。

图 4. 候选抗体的验证

试验为了评估ML7对候选蛋白的特异性，使用了所有Frizzled蛋白(不包括Fzd3)进行ELISA检测。结果显示，ML7对Fzd1/2/7均有亲和力，但对Fzd5/8的亲和力很低。表明ML7具有特异的结合能力（图5）。为了进一步比较结合物，我们使用流式细胞仪阻断试验进行了初步的表位结合分析。结果显示所有组合均有阻断作用，但当OMP18R5为阻断剂时，效果最差（图6）。这些结合情况的差异可能具有临床相关性，因为OMP18R5的临床试验由于骨相关不良事件而停止，而Fzd8是已知的骨重塑调节因子。结果显示，ML7对Fzd7具有更高水平的特异性，这可能有利于临床开发应用。

图 5. 候选抗体与Frizzlea蛋白家族结合ELISA检测

图 6. 候选抗体与Frizzlea蛋白家族阻断试验

✎ 结论  

目前微流控平台已被用于自动化的生物筛选并实现了在细胞上进行筛选。微流体噬菌体展示平台能够显著减少生物筛选轮数，或能够为传统筛选方法发现关键靶向物。μCellect只需要两轮筛选就可以找到人类Frizzled-7的高亲和力结合物，这是传统生物筛选的一个具有挑战性的目标。 Fzd7在乳腺、胶质母细胞瘤、结直肠癌、和非小细胞肺癌中的Wnt信号通路和过表达中具有关键功能作用和关键治疗作用。Fzd7是一种α-螺旋G蛋白偶联受体(GPCR)类跨膜蛋白，由于它们的水溶性差，构象变异性高，细胞外区域小，以及相对于大多数细胞表面组织低表达，这类靶点对噬菌体展示平台是G具有挑战性的。 MICS设备可以实现较高的处理速度，同时也可以处理低细胞数，如原代细胞类型和某些罕见细胞。目标细胞可以使用已知的细胞表型的生物标记物来捕获。虽然与Fzd7的结合物仅在两轮筛选中就被识别出来，但在未来很可能只需要一轮筛选就可得到。除了在生物筛选过程中取得的改进外，μCellect还提供了一种有技术有价值的选择方法——k-means分类方法。k-means分类方法的关键之处在于它并非独立地考虑每个克隆，而是识别了所有富集的克隆的CDR结构的趋势，并选择最能代表这些趋势的克隆。这种方法的另一个优点是，它不需要进行预实验。有监督的机器学习方法需要使用预先存在的数据，这对于未知的抗原存在着很大的局限性。μCellect首此尝试使用无监督机器来选择有效抗体，并取得了成功。 在本文的抗体筛选中，得到的三个候选克隆(ML7、ML8和ML9)对Fzd7均表现出高亲和力，证明了这种筛选方法的可行性。而使用传统富集方法筛选得到的候选克隆(TA1和TA2)未能证明与抗原特异性结合。ML7、ML8和ML9是在k-means算法中富集程度最高的真实克隆，这证实这种算法具有不错的可靠性。 总之，μCellect是一种新型的噬菌体展示平台，它利用微流体和机器学习结合的技术来解决传统噬菌体展示平台的相关问题。在对人类Frizzled-7的两轮细胞筛选中，我们确定了具有皮摩尔亲和力的结合物。这表明了μCellect在筛选有挑战性的蛋白靶点和减少抗体开发时间线方面具有实用性并且有很大的发展潜力。

原文链接：

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC8796304/

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