苯丙酮尿症（phenylketonuria，PKU）是一种苯丙氨酸代谢异常引发的常染色体隐性遗传疾病。PKU疾病数据库中已发现1281个位点变异，其中980个是错义突变。肝脏细胞中的苯丙氨酸羟化酶（PAH）负责将源自食物中的苯丙氨酸（Phe）分解为酪氨酸（Tyr），而酪氨酸是合成多巴胺，肾上腺素等神经递质以及黑色素的关键前体。苯丙氨酸羟化酶是一种同源四聚体，其催化活性需要四氢生物喋呤（BH4）作为辅因子才能发挥功能。苯丙氨酸羟化酶或者四氢生物喋呤的缺乏或者会导致血液中苯丙氨酸浓度的升高，引发高苯丙氨酸血症（hyperphenylalaninemia，HPA）。

临床上将高苯丙氨酸血症可以分为两大类：PAH缺乏症和BH4缺乏症。根据苯丙氨酸羟化酶活性丧失的程度和血液中苯丙氨酸浓度，可以对PAH缺乏症进行更进一步的划分。苯丙氨酸在血液中正常的浓度为<120umol/L。如果PAH酶活性完全丧失，导致典型PKU（Phe>1200 μmol/L）。如果PAH酶活性如有残余，可引起中度PKU（Phe为900-1200 μmol/L），轻度PKU（Phe为600-900 μmol/L），轻度高苯丙氨酸血症 （Phe为360-600 μmol/L）及通常无需治疗的良性轻度HPA（Phe为120-360 μmol/L）。另一方面，BH4合成代谢需要5种酶，缺乏任何一种就会导致BH4缺乏症，其中6-丙酮酰四氢蝶呤合成酶缺乏和二氢蝶啶还原酶缺乏最为常见。 

如果放任苯丙酮尿症不加以治疗会导致严重的不可逆转的智力损伤。早期的检测和预防能够让患者血清苯丙氨酸维持在一个正常的范围内（120-360 μmol/L）。对于新生儿的早期筛查能够确保及早发现PKU患者，启动苯丙氨酸限制性饮食，从而避免对神经系统造成不可逆损伤。然而，对于对于年龄较大的孩子和成人来说，很难持久遵守严格的限制性饮食。一旦这些PKU患者摄入高蛋白的肉类，会导致血清苯丙氨酸浓度升高，引发严重的健康问题。 

目前，有两款药物获FDA批准治疗苯丙酮酮尿症：Sapropterin和Pegvaliase。Sapropterin是BH4的合成形式，充当苯丙氨酸羟化酶的辅因子，可激活残存的苯丙氨酸羟化酶活性。但是，由于Sapropterin的治疗效果依赖苯丙氨酸羟化酶，仅仅在BH4缺乏类型的PKU患者种才显现治疗效果，而且大多数患者必须配合苯丙氨酸限制性饮食才能使得血清苯丙氨酸浓度维持在正常范围内。Pegvaliase是源自细菌的聚乙二醇化的苯丙氨酸氨裂酶（Phenylalanine ammonia lyase），催化苯丙氨酸降解为氨合反式肉桂酸。聚乙二醇化降低细菌来源的苯丙氨酸氨裂酶的免疫原性。与苯丙氨酸羟化酶相对比，苯丙氨酸氨裂酶的优势在于不需要任何辅因子。然而，使用Pegvaliase的几乎所有病人（93.5%）都会发生超敏不良反应，还有一部分病人（4.6%）甚至会发生过敏休克，因此FDA在批准Pegvaliase时，伴随发布黑框警告。 

2022年6月14号，Arcturus Therapeutics的研发人员在 Molecular Therapy : Nucleic Acids 期刊发表了题为： Development of an mRNA replacement therapy for phenylketonuria 的研究论文。 

该研究开发了mRNA替代疗法治疗苯丙氨酸羟化酶缺乏症，使用源自 Arcturus 专利的 LNP-LUNAR 包封编码人苯丙氨酸羟化酶的全长mRNA，将LUNAR-hPAH mRNA静脉注射到PKU小鼠模型体内。

结果发现，在小鼠肝脏细胞种可以观察到大量的hPAH表达，小鼠体内的苯丙氨酸代谢得到恢复，血清中高浓度的苯丙氨酸发生显著下降。这项工作利用mRNA技术实现体内代谢酶的替代治疗，为苯丙酮尿症的治疗开拓出一种全新的治疗平台 。

苯丙酮尿症小鼠模型-Pahenu2mice

Pahenu2小鼠模型由于Pahenu2等位基因发生突变，导致苯丙氨酸羟化酶活性发生严重下降，引起血清苯丙氨酸浓度升高，血清酪氨酸浓度降低，使其非常适合作为经典PKU的临床前动物模型。

用正常食谱饲喂野生型和Pahenu2 杂合体小鼠，血清苯丙氨酸浓度接近100-120umol/L，血清酪氨酸浓度也接近100-120umol/L，两者浓度的比例（Phe:Tyr）等于1。Pahenu2纯合体小鼠摄取正常食谱时，血清苯丙氨酸浓度接近2000-2500umol/L。同野生型和Pahenu2 杂合体小鼠相比较，血清苯丙氨酸浓度增加20倍。Pahenu2纯合体小鼠血清酪氨酸浓度接近40umol/L，而血清苯丙氨酸浓度和酪氨酸浓度比值超过50。

用不含苯丙氨酸的特制食谱 （补充含极低Phe的水） 饲养小鼠。对于野生型和Pahenu2 杂合体小鼠，血清苯丙氨酸浓度接近40-80umol/L，血清酪氨酸浓度也接近此水平，两者比值等于1。相反，对于Pahenu2纯合体小鼠，血清苯丙氨酸浓度从刚开始的2000 umol/L降低到350 umol/L，降低幅度超过6倍；Pahenu2纯合体小鼠体内的血清酪氨酸浓度和野生型以及Pahenu2 杂合体小鼠类似；血清苯丙氨酸浓度和酪氨酸浓度比值接近2-8。 

总结来说，野生型和Pahenu2 杂合体小鼠能够调控和代谢外源苯丙氨酸，而Pahenu2纯合体小鼠无法代谢外源苯丙氨酸，会引发高苯丙氨酸血症。

苯丙氨酸羟化酶mRNA序列优化

研发人员通过两者策略来优化编码苯丙氨酸羟化酶的mRNA序列，以提升其在肝脏细胞中的蛋白表效率和蛋白稳定性。第一种策略是优化CDS区域，包括密码子优化，蛋白稳定性优化，mRNA稳定性优化。PAH某些结构域与功能无关，但是会影响蛋白稳定性。通过引入磷酸化或者泛素化等修饰来提升稳定性。第二种策略是筛选最优UTR序列。将筛选出的最优CDS序列和最优UTR序列组合成为最终的hPAH-mRNA序列。

重复注射LUNAR-hPAH mRNA效果

向正常食谱饲喂的Pahenu2纯合体小鼠体内间隔3天注射3mg/kg LUNAR-hPAH mRNA或者LUNAR buffer （LNP对照组） 。注射LUNAR-hPAH mRNA的小鼠血清苯丙氨酸浓度在每次注射6h后会下降至少50%。在每次注射LUNAR-hPAH mRNA 24h 后，小鼠血清苯丙氨酸浓度会再度回升到基线20%以内。Pahenu2纯合体雄性小鼠血清苯丙氨酸浓度下降程度明显超过雌鼠。这种性别差异只存在于PKU小鼠模型中，在非人灵长类动物或者人类中没有报道过类似的情况。

检测每次注射LUNAR-hPAH mRNA后，血清苯丙氨酸浓度和酪氨酸浓度以及两者之间的比例，可以看到重复注射会产生一个降低血清苯丙氨酸浓度的累积效应。每次注射6h后，血清苯丙氨酸浓度降到最低，血清酪氨酸浓度升到最高。这表明hPAH mRNA在小鼠肝脏细胞中正常表达，使得苯丙氨酸代谢恢复正常，可以将苯丙氨酸转变为酪氨酸。每次注射48h后，血清苯丙氨酸浓度和酪氨酸浓度回复到接近注射前的水平。 

总结

在2022年5月，他们还开发出编码细菌来源或者植物来源的苯丙氨酸氨裂酶的PAL-mRNA，使用Arcturus专有的LNP -LUNAR包封,靶向递送到PKU小鼠肝脏细胞中，替代苯丙氨酸羟化酶，成功降低血清苯丙氨酸浓度。 

这两项工作为我们展现了mRNA技术在蛋白替代疗法方面非常典型的应用案例。最近几年，基于腺相关病毒的苯丙酮尿症基因治疗方法显示出非常有前景的结果，可以更加持久地降低血清苯丙氨酸浓度。但是，考虑到免疫原性，转导效率以及非特异性插入，使用mRNA技术显然具备更加显著的优势。hPAH mRNA直接被递送到细胞质中，不需要进入细胞核，避免发生任何潜在的非特异性基因组插入事件。化学修饰的hPAH mRNA能够降低免疫原性，提升翻译效率和稳定性，更加适合进行重复多次地注射给药。此外，还可以调节LUNAR 脂质体纳米颗粒的成分，使其 可以更好地靶向富集到肝脏细胞。 

总的来说，PAH或者PAL mRNA替代疗法在治疗苯丙酮尿症上具有明显优势，可以消除对于限制性饮食的依赖，恢复PKU病人体内的苯丙氨酸代谢，降低血清中高浓度的苯丙氨酸，避免任何潜在的有害副作用，是一种非常有前景的新型治疗方案。 

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