导读  
目的：由于有效治疗方法有限(特别是口服药物有限)，肥胖流行及其代谢并发症仍然是一个重大的全球公共卫生威胁。肽是一类很有前景的分子，因其在医学和生物技术中的应用而受到越来越多的关注。本研究专注于寻找可以口服治疗肥胖的肽，并探索其机制。  
方法：本研究设计了一种名为D3的9-氨基酸肽，并将其口服给药于无菌(GF)小鼠和野生型(WT)小鼠、大鼠和猕猴。评估D3对体重和其他基础代谢参数的影响。使用16S rRNA扩增子测序评估D3对肠道微生物群的影响。为了确定D3的作用机制，对三种动物模型进行了回肠转录组分析和分子方法研究。  

结果：经D3处理的WT(12%)和GF(9%)小鼠体重均显著下降。D3改善了瘦素抵抗并上调了尿鸟苷(UGN)的表达，UGN通过UGN-GUCY2C内分泌轴抑制食欲。在饮食诱导的肥胖大鼠和猕猴模型中也发现了类似的影响。此外，D3处理后肠道中Akkermansia muciniphila的丰度通过IFNγ-Irgm1轴增加了约100倍，这可能通过下调Cd36进一步抑制脂肪吸收。

结论：本研究结果表明，D3作为一种无毒且具有生物活性的肽，是一种对抗饮食诱导的肥胖的新型候选药物；靶向UGGNUCY2C内分泌轴可能是治疗肥胖症的一种治疗策略。 

论文ID 

原名：A novel peptide protects against diet-induced obesity by suppressing appetite and modulating the gut microbiota

译名：一种新型肽通过抑制食欲和调节肠道微生物群来预防饮食引起的肥胖

期刊：Gut

IF：31.793

发表时间：2022.7

通讯作者：赵方庆＆魏泓

通讯作者单位：中国科学院北京生命科学研究院；陆军军医大学基础医学院

DOI号：10.1136/gutjnl-2022-328035

实验设计

结果

1 口服D3可对抗肥胖
增加电荷和疏水性可以提高肽的膜通透性。因此，为了增强疏水性，从人十二指肠液中被蛋白酶降解的HD5片段之一HD5(1-9)修饰了四个名为D1-4的肽，HD5(1-9)是防御素HD5-N端的前9个氨基酸。所有这些肽都带正电荷，其中D3穿透细胞膜的潜力最强(在线补充表1和图1A)。然后，我们评估了D1-4在哺乳动物细胞中的细胞毒性。在非常高的浓度(29 μM)下，D1-3显示出对细胞活性的轻微抑制(2.71%-5.42%)，表明其细胞毒性较低(在线补充图1a)。此外，我们还在体外检测了D1-4对小鼠红细胞的潜在毒性作用。如在线补充图1b所示，D1-4在28 μM时的溶血率分别为1.06%-3.61%，表明其溶血作用较低。因此，这些小肽的安全浓度范围设定为0~27 μM。 接下来，我们比较了每日给药D1-4对HFD喂养小鼠的影响。值得注意的是，在暴露于HFD 8周后，与对照组小鼠相比，HFD喂养的小鼠口服D3(而非其他肽)导致体重增加减少12.06%±2.35%(图1B-D)。最近的研究表明，肥胖及其伴随的代谢状态越来越多地与肠道微生物群的组成有关。为了检验肠道微生物群是否可能促成这一效应，在限菌(抗生素鸡尾酒，ABX)和无菌(GF)小鼠中重复了相同的实验。同样，在ABX小鼠(在线补充图1C)和GF小鼠(图1D)中分别观察到体重下降分别为9.65%±4.26%和9.14%±2.93%，这表明D3灌胃减少肥胖可能部分独立于肠道微生物组。 当给予额外的胰岛素和葡萄糖刺激时，D3处理的小鼠表现出与NC组小鼠相似的葡萄糖清除动力学，这表明D3可以降低肥胖引起的胰岛素抵抗(图1E,F)。经D3处理后检测到腹股沟、附睾和肾周脂肪组织重量显著降低(p<0.05，Wilcoxon检验)，这可能与脂肪细胞体积减小有关(图1H)。此外，D3治疗还能防止肝脏脂肪变性(图1H)。 基于这些发现，我们进一步研究了在HFD喂养10周后，在一组新的DIO小鼠(n=5)中口服给药D3(持续4周)的影响。在DIO小鼠中观察到体重显著下降(p<0.01, Wilcoxon检验)(图1I)，而在同时喂食10周饲料的瘦小鼠(n=5)中，这一趋势趋于温和(p<0.05, Wilcoxon t检验)(图1J)。值得注意的是，在第14周交换饮食后也观察到了类似的效果(图1I, J)。综上，这些结果表明，D3治疗可以预防DIO的发作和恶化，特别是HFD(在线补充图1e)。

图1 口服D3可对抗肥胖。(A) HD5(1-9)衍生肽D1-4及其两亲性表面的设计。蓝色、红色和白色分别代表正电荷、负电荷和中性电荷。使用PyMOL 3.0生成分子模型。(B)实验大纲。(C-H)将小鼠分为3组(正常饮食(NC)、高脂饮食HFD)和D3)，分别饲喂标准正常饮食或60%脂肪饮食10周；D3组灌胃D3，以生理盐水作为平行对照(HFD)。(C)第8周SPF小鼠的代表性图片。D3组的小鼠体重减轻，毛发梳理更好。(D-F)SPF显示在顶部，无菌(GF)显示在底部。(D) 4周龄开始测量的体重增加克数；SPF小鼠(每组n=10-12)；GF小鼠(每组6-8只)。代表三个独立实验。(E, F) SPF小鼠和GF小鼠的胰岛素耐量试验(ITT)(E)和口服葡萄糖耐量试验(OGTT)(F)。(G)不同器官组织中白色脂肪含量总重。代表三个独立实验。(H) HFD组和D3组小鼠肝脏和附睾脂肪H&E染色，放大倍数20倍。比例尺：100 μm，每组n=10。(I,J)实验大纲(上)；4周龄开始测量的体重增加克数，并在第14周更换饲料。对于D-G、I和J，p值由双尾Wilcoxon检验确定，数据以平均值±SEM表示；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
2 D3通过抑制食欲来维持能量平衡
考虑到当能量摄入超过能量消耗时就会发生肥胖，因此我们评估了口服D3是否会影响食物摄入和/或能量代谢。值得注意的是，在无特定病原体(SPF)小鼠和GF小鼠中，随着时间的推移，D3处理显著减少了食物摄入量，与对照处理动物相比，24小时食物摄入显著减少(p<0.05, Wilcoxon检验)(在线补充图1d和图2A,B)。此外，还进行了间接量热分析，以确定能量消耗的变化是否有助于观察到的D3介导的体重减轻。如图2C所示，两组之间的能量消耗几乎没有差异(p>0.05, Wilcoxon检验)，表明D3处理可能影响能量摄入而不是能量消耗。进行配对喂养以探索降低食物超负荷的影响。结果，在暴露于HFD的8周内，口服D3的小鼠与HFD对照小鼠相比，体重增加减少了10.04%±2.19% (p<0.01, Wilcoxon检验)(图2D)。此外，配对喂养组小鼠的体重增加减少了6.02%±2.03%。这些结果表明，D3的生理作用主要是基于对小鼠食欲的抑制。 为了进一步探索D3的作用机制，我们使用FITC标记的D3 (FITC-D3)可视化其在小鼠中的全身分布。口服FITC-D3或FITC 3小时后，在FITC-D3处理的小鼠肠道内可见强烈的荧光，特别是在远端小肠，但在FITC组的小鼠中没有(图2E)。除了肝脏中略有分布外，在其他器官(心脏、脾、肺和肾)中未观察到FITC-D3的分布(图2E和在线补充图2a)。FITC-D3处理24小时后，包括肠道在内的上述任何器官中均未观察到荧光，表明D3的主要作用靶点是远端小肠，且其半衰期较短。 一些富含精氨酸和赖氨酸残基的小肽具有显著的细胞摄取能力，可以结合细胞内靶点或将静电生物活性物质递送到细胞内。为了确定D3是否可以穿透细胞膜，将HCT细胞与10 μM FITC-D3/FITC共培养2 h。共聚焦显微镜显示，FITC-D3均匀分布在HCT细胞的胞浆中，并显示出比FITC显著更高的荧光强度(图2E和在线补充图2b)，表明与D3结合后细胞摄取增强。D3在穿透细胞膜方面的高效率支持其作为细胞内调节剂的潜力。 随后，我们通过转录组分析研究了D3是否可以调控小鼠远端小肠中基因的表达。基因集富集分析表明，与HFD对照相比，D3处理小鼠中参与代谢和炎症反应的几个KEGG途径，如调节脂肪细胞分化、正调节分解代谢过程和负调节I-kappaB激酶/NF-kappaB信号通路是最显著富集的途径(图2F)。此外，通过差异表达分析确定了D3小鼠回肠中有121个基因表达上调(p<0.05，Wald检验)。通过实时定量PCR验证了几个参与脂解调控的基因，如Zbtb1624、酰基辅酶A氧化酶2(Acox2)，和炎症抑制相关基因Zfp3626，特别是Guca2b基因(校正后p<0.01)(在线补充图3b-d和图2G)。在脂肪组织中也发现了类似的结果：D3处理增加了脂肪细胞分化标志物(如Cebpa编码的CCAAT/增强子结合蛋白-α)和脂质氧化标志物(如Acox2)的mRNA表达，并降低了脂肪生成标志物(如Fasn编码的脂肪酸合成酶)的表达(在线补充图3b)。先前的研究发现，Guca2b可通过UGN-GUCY2C内分泌轴调节食物摄入，从而起到体重稳态调节剂的作用。我们通过ELISA进一步验证了血清中UGN水平的变化。值得注意的是，通过免疫荧光评估，D3处理显著上调了SPF小鼠和GF小鼠中UGN的表达(p<0.01，Wilcoxon检验)(图2H-J和在线补充图3e)。

图2 D3处理通过上调回肠中尿鸟苷(UGN)的表达来减少食物摄入。(A, B)每周测量一次食物摄入量。(C) D3处理对急性食物摄入的影响，每隔一天测量一次，持续1周。A和B分别为(A) (SPF小鼠，n=10-12)，(B)(无菌小鼠，n=6-8)。(C) SPF小鼠20小时的能量消耗(每组n=6)。(D)从4周龄开始，配对喂养的小鼠随时间的体重增加克数(每组6只小鼠)。(E)通过共聚焦显微镜观察FITC标记的D3的定位。细胞核用DAPI染色(蓝色)。口服给药3小时后取SPF小鼠的Swiss rolls(上图，比例尺：500 μm)和肠道横截面(下图，比例尺200 μm)。最后一列显示FITC-D3在与HCT细胞共培养1小时后的定位。FITC呈现的洋红色是一种伪色，后来被替换以区别于UGN的免疫荧光染色。图像代表具有相似结果的三个独立实验。(F)回肠基因的RNA测序和KEGG通路。(G)火山图显示D3处理组与HFD对照组的相对基因表达。绘制了所有基因，每个圆圈代表一个基因。圆的直径表示FPKM的值，p<0.05(绿色)和p<0.01(红色)。x轴显示log2倍数变化，y轴显示p值的-log10。(H)灌胃D3或磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)的小鼠回肠中Guca2b mRNA的相对水平。(I)采用ELISA法测定小鼠血清中UGN(Guca2b蛋白)的浓度(ng/mL)。(J)回肠切片双重免疫荧光染色检测UGN(绿色点位于肠上皮细胞底部)和细胞核(蓝色)。漫反射绿色薄层是背景噪声。比例尺:10 μm。对于A、B、H和I，p值通过双尾Wilcoxon检验确定，数据以平均值±SEM表示；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
3 完整的瘦素信号有助于D3的抗肥胖作用
我们试图确定D3处理是否可以预防遗传肥胖(ob/ob)小鼠的肥胖。如图3A所示，口服给药6周后，D3组ob/ob小鼠体重增加与HFD组无明显差异。为了验证D3的抗肥胖作用与瘦素相关，我们接下来回顾性检查了在之前实验中处理的SPF小鼠中瘦素表达的变化。事实上，与之前的报道一致，喂食HFD显著上调了SPF和GF小鼠中瘦素的表达，这可以通过口服D3来恢复(p<0.05, Wilcoxon检验)(图3B)。为了进一步证明D3可以改善瘦素抵抗，我们首先通过急性方法研究了体重对瘦素给药的反应，其中WT小鼠腹腔注射瘦素3天，然后测定它们的体重变化。如图3C、A所示，经外源性瘦素处理后，D3组小鼠体重明显下降(p<0.05, Wilcoxon检验)，但HFD组小鼠体重没有明显下降。其次，我们检测了瘦素刺激的细胞因子，包括信号转导和转录激活因子3(STAT3)和磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)通路。我们发现，在瘦素信号传导的负调控因子中，HFD和D3组之间PTB1B的mRNA表达水平没有显著差异(在线补充图4b)，但在D3处理的小鼠中，SOCS-3显著下调。在体内，SOCS-3过表达抑制瘦素诱导的pSTAT3，从而导致瘦素抵抗。相反，PI3K的表达水平显著上调，其表达水平与总表达水平呈正相关，可以反映瘦素敏感性，这可能代表对瘦素的反应增强(在线补充图4b)。综上，这些结果表明，D3处理可以恢复DIO小鼠中瘦素诱导的信号通路和瘦素敏感性。 本研究观察到，瘦素处理导致ob/ob小鼠体重明显下降，而瘦素+D3引起的体重下降比单独D3更显著(图3D)，这意味着补充外源性瘦素可以恢复D3在ob/ob小鼠中的功能。然后，我们定量并比较了ob/ob小鼠和WT小鼠回肠中Guca2b的表达水平。与未处理的ob/ob小鼠(OB-NC)相比，D3处理ob/ob小鼠(OB-D3)中Guca2b的表达增加了2.22倍，而SPF-D3组的WT小鼠则增加了3.67倍(图3E)。此外，仅用瘦素(OB-Lep)处理的ob/ob小鼠(ob/ob小鼠)增加了2.12倍，低于用瘦素+D3处理的小鼠(OB-Lep+D3，增加了3.46倍)(图3E)，表明瘦素和D3对调节UGN表达的协同作用。通过免疫荧光进一步观察和验证D3、瘦素和D3+瘦素处理的ob/ob小鼠回肠中UGN的表达(图3F)。综上，这些发现表明瘦素可能在介导D3的厌食和抗肥胖作用中发挥重要作用。 下丘脑中与食欲相关的一些神经元在禁食时被激活，伴随着这些神经元中c-Fos表达的显著诱导。为了观察D3处理对小鼠食欲的影响，在上午10:00给8周龄SPF小鼠灌胃D3或对照物(生理盐水)。随后每1小时进行一次Transcardial及c-Fos染色，持续3小时。D3给药后1小时c-Fos表达明显升高，随后逐渐恢复正常水平(在线补充图4c)，后续免疫荧光染色证实(图3H,J)。我们进一步测量了在此过程中AgRP和POMC的表达，以确定与观察到的效应有关的下丘脑神经元群。D3给药后2小时和3小时POMC的表达明显改善(p<0.05, Wilcoxon检验)，但AgRP无明显变化(p＞0.05, Wilcoxon检验)(图3G,K)。此外，在弓状核中观察到c-Fos和POMC表达神经元的共定位(图3H,I)。上述结果表明，D3给药可能间接影响弓形核中的POMC神经元，其发出饱腹信号并减少食物摄入，从而达到抑制食欲的效果。

图3 D3增加小鼠瘦素敏感性和ARC c-Fos表达。(A)随时间推移测量的体重增加百分比(ob/ob小鼠，每组n=8)。(B)用D3或生理盐水(对照)灌胃饲喂高脂饮食(HFD)或正常饮食(NC)的特定无病原体/无菌(SPF/GF)小鼠后附睾脂肪的瘦素mRNA表达水平(SPF小鼠，n=10-12；GF小鼠，n=6-8)。(C)外源性瘦素或生理盐水处理后的体重变化(野生型(WT)小鼠，n=7-8)。相同颜色的Lute图代表两组接受相同处理的小鼠。(D)正常饮食的ob/ob小鼠经不同处理后体重增加百分比(NC，n=3；D3、瘦素和D3+瘦素，n=4)。(E) ob/ob或WT小鼠中的Guca2b mRNA表达水平(ob/ob小鼠，每组n=3-4;WT小鼠；每组n=8-10)。(F)回肠切片双重免疫荧光显示尿鸟苷(UGN)(位于肠上皮细胞底部的绿点)和细胞核(蓝色)。比例尺：10 μm。(G) WT小鼠中AgRp和POMC mRNA表达水平(每组n=3)。(H) SPF小鼠中ARC c-FOS(红色)和POMC(绿色)的代表性图像。比例尺:100μm；3v，第三脑室。(I) c-Fos阳性细胞与POMC神经元共定位。(J)小鼠ARC中c-Fos阳性细胞/玻片数量。(K) ARC切片双重免疫荧光染色显示POMC(绿色)和细胞核(蓝色)。比例尺:100μm；3v，第三脑室。对A-E、H和J，p值通过双尾Wilcoxon检验确定，数据以平均值±SEM表示；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
4 D3处理增加了肠道菌群中A. muciniphila 的丰度
肠道微生物群是代谢功能的重要贡献者，并与人类疾病的发展有关，例如婴儿自闭症和肥胖症。我们接下来研究了D3对肥胖的保护是否与肠道微生物群的改变相关。D3处理小鼠和对照处理小鼠之间的粪便微生物群组成存在明显差异(图4A、B和在线补充图5a-c)。线性判别分析显示，Oscillospira、Lawsonia和Desulfovibrio在对照处理小鼠中显著富集，而Bacteroides、Bilophila和Akkermansia在D3处理小鼠中显著富集(图4C)。 粪便微生物群移植(FMT)是指将健康供体的肠道微生物群落转移到患者体内，已成为治疗一系列慢性疾病的一种有前景的治疗选择。虑到肠道微生物群的组成变化可能在D3治疗过程中发挥作用，我们采用FMT来确定肠道菌群是否有助于拯救肥胖。收集用D3处理10周小鼠的粪便微生物群，并口服给药DIO小鼠。4周后，与HFD对照组小鼠相比，FMT使受体小鼠的体重减轻6.50%±2.91%，而热灭活的粪便样本则无任何影响(图4D,E)。我们想知道是否有某种特定的粪便细菌发挥了这种保护作用。因此，我们在D3处理的DIO小鼠中使用了两个显著富集的分类群(B. vulgatus和A. muciniphila)，持续4周。和A. muciniphila的定殖导致体重显著下降(p<0.05，Wilcoxon检验)，而B. vulgatus的定殖没有这种影响(p>0.05, Wilcoxon检验)(图4F)。这一发现表明，转移到受体小鼠的肠道微生物群的个体成员(如A. muciniphila)可能会延缓DIO小鼠的肥胖发展，这与之前的研究一致。然后我们回到SPF小鼠的初始实验，发现D3处理小鼠粪便中A. muciniphila的丰度大约是HFD小鼠的100倍(图4G)。 最近，A. muciniphila被鉴定为一种存在于粘液层中的粘蛋白降解细菌，其在粘液蛋白降解中的特化作用使其成为管腔和宿主细胞之间粘膜界面的关键角色。通过对结肠上皮粘液进行染色，我们发现HFD喂养的小鼠(SPF)中粘液层厚度明显降低。D3和A. muciniphila处理都抵消了这种下降(p<0.05, Wilcoxon检验)。有趣的是，当使用D3处理GF小鼠时，这种效果消失了(图4H,I)。因此，我们推测粘液层增厚是由于A. muciniphila的定殖，而不是D3的直接作用。 为了进一步探索D3处理导致A. muciniphila丰度增加的机制，我们首先在体外测量了暴露于不同浓度D3时A. muciniphila的生长曲线。如图4J所示，不同D3浓度下无明显变化，说明D3在体外并不能促进A. muciniphila的生长。先前的研究发现，在IFNγ缺陷小鼠中A. muciniphila显著增加，并且IFNγ水平的恢复可以降低A. muciniphila的丰度。IFNγ可以通过Irgm1诱导Paneth细胞分泌抗菌蛋白，Irgm1是其信号级联的下游分子。先前的研究表明，当IFN或Irgm1水平降低时，抑菌肽的产生受损会导致A. muciniphila的过度生长。在本研究中，我们观察到，相对于HFD组，D3处理显著抑制了小鼠回肠中IFNγ和Irgm1的表达(图4K,L)。因此，我们推测D3处理增加了A. muciniphila丰度可能是由于IFNγ-Irgm1轴的负调控。 为了研究A. muciniphila是否有助于改善肥胖表型，我们将A. muciniphila移植到DIO小鼠体内8周。值得注意的是，每2天用1×109 CFU A. muciniphila灌胃小鼠，导致小鼠体重显著降低(p<0.01, Wilcoxon检验)，与D3处理相似(图4M)。我们进一步比较了A. muciniphila和D3对DIO小鼠脂质代谢的影响。我们观察到，在SPF小鼠(而非GF小鼠)给药D3或A. muciniphila后，调节脂质合成和吸收的Fasn和CD36 mRNA表达增加，促进附睾脂肪中脂质氧化的Adipoq mRNA水平降低(在线补充图5f)，这表明增加的A. muciniphila有额外的积极作用。有趣的是，仅在D3处理的SPF小鼠中观察到Acox2的显著上调，它可以增加脂肪酸氧化并进一步抑制肝脏中的脂质积累(图4N和在线补充图5f)。以上结果表明，脂质代谢的调节应该是D3和A. muciniphila二者共同作用的结果。 最近的研究表明，A. muciniphila可以修复由高脂(HF)饮食引起的肠粘液变薄。因此，我们进一步研究了D3或A. muciniphila给药对结肠粘液的影响。我们发现，在SPF小鼠中给药D3或A. muciniphila后MUC2和IL4的表达水平显著增加(p<0.05，Wilcoxon检验)，但在杯状细胞发育的其他标志物中没有增加，如Klf4(p >0.05，Wilcoxon检验)(在线补充图5d-e)。然而，D3处理的GF小鼠并没有出现相同的结果，这表明粘液层增厚可能归因于A. muciniphila丰度的增加，而不是D3的直接作用。

图4 D3改变了小鼠的肠道微生物群。(A)在属水平上高脂饮食(HFD)处理和D3处理小鼠的粪便微生物群组成。(B) HFD和D3小鼠粪便微生物群的主成分分析(PCoA)。Adonis检验两个分离簇的显著性。(C) LEfSe分析显示HFD和D3之间的显著差异丰度细菌类群。在D3处理的小鼠中，类群显著富集和减少分别显示为红色和黑色。(D)粪便微生物群移植(FMT)的实验流程。首先给小鼠喂食HFD 10周，以实现饮食肥胖。在接下来的4周内，使用D3处理的小鼠作为供体。收集它们的粪便，然后分为灭活组和活性组，最终通过FMT转移到受体小鼠。此外，A. m和B. v组小鼠灌胃1×109 CFU Akkermansia muciniphila或Bacteroides vulgatus。供体和受体，每组n=6；A. m和B. v组，每组n=5。(E-F)从第14周开始，随时间测量的体重增加百分比(E，FMT；F，外源细菌定殖)。(G)定量PCR测定小鼠粪便样本中A. muciniphila的相对丰度，见图1D。(H-I)高碘酸Schiff(PAS)和阿尔新蓝(AB)染色(H)以及来自SPF小鼠和无菌(GF)小鼠以及外源性细菌定殖小鼠的结肠切片的粘液层厚度(I)(图1D)。白色虚线代表粘液层的边界。(J)在体外暴露于不同浓度D3的A. muciniphila的生长曲线。代表三个独立实验。(K-I)图1D中SPF小鼠回肠中IFNγ(K)和Irgm1(L) mRNA表达水平，随时间测量的体重增加百分比(每组n=6只小鼠)。(N)饲喂对照饮食(NC和HFD)或D3处理或灌胃A. muciniphila的SPF小鼠(每组n=6)的CD36、Fasn和Acox2(肝脏)和Adipoq(附睾)mRNA表达水平。对于E-G、I和K-N，p值通过双尾Wilcoxon检验确定，数据以平均值±SEM表示；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
5 D3在其他动物模型中的抗肥胖作用
为了研究D3在其他动物中的抗肥胖作用，我们进一步用D3处理了另外两种DIO模型，大鼠和猕猴(图5A,H)。值得注意的是，在HFD暴露的10周内，与未处理对照相比，D3处理导致大鼠体重增加减少了8.96%±3.11% (p<0.05, Wilcoxon检验)(图5B,C,I)。正如预期的那样，我们观察到与HFD对照大鼠相比，D3处理显著抑制了DIO大鼠的摄食量(p<0.05, Wilcoxon检验)(图5D)。回肠中Guca2b的表达显著升高(p<0.05, Wilcoxon检验)，附睾脂肪中瘦素的表达显著降低(p<0.05, Wilcoxon检验)(图5E,F)。同样，A. muciniphila的丰度增加(p<0.05, Wilcoxon检验)(图5G)。对于DIO猕猴，第6周D3组的平均增重增幅比对照组低7.71%±2.97%(图5j)。(图5)。此外，我们观察到，D3组猕猴的摄食量显著降低(p<0.05, Wilcoxon检验)(图5J)，A. muciniphila的丰度增加(p<0.05, Wilcoxon检验)(图5K)。

图5 D3保护大鼠和猕猴免于饮食肥胖。(A)大鼠实验工作流程(每组n= 8-10)。(B)随时间测量的大鼠体重增加克数。(C)随时间测量的大鼠体重增加百分比。括号表示高脂饮食(HFD)和D3之间的比较。(D)每隔一天测量一次大鼠的食物摄入量，持续1周。(E)大鼠回肠中Guca2b mRNA表达水平。(F)大鼠附睾脂肪的瘦素mRNA表达水平。(G)大鼠粪便样本中Akkermansia muciniphila的相对丰度。(H)喂食标准饮食(正常食物，NC)或HFD 6周(每组n=3)的猕猴的实验工作流程。(I)随时间测量的猕猴体重增加百分比。括号表示HFD和D3之间的比较。(J)每隔一天测量一次猕猴的食物摄入量，持续1周。(K)猕猴粪便样本中A. muciniphila的相对丰度。(L) D3在治疗肥胖中的作用总结。D3作为瘦素增敏剂，可以上调回肠中尿鸟苷(UGN)的表达，并通过靶向下丘脑抑制食欲。D3还可以增加肠道中A. muciniphila的丰度，进而影响肝脏的脂质吸收和代谢。对于B-G和I-K，p值通过双尾Wilcoxon检验确定，数据以平均值±SEM表示；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

讨论

尽管多年来肥胖管理已有了显著改善，但仍缺乏针对其潜在过程的疗法。人们对支持减肥的药物疗法越来越感兴趣。目前，人体中的一些内源性肽已被用于治疗2型糖尿病和肥胖，如K-酪蛋白衍生的糖原肽和酪蛋白。此外，一些肠道肽(如α-防御素5)被用于逆转血脂异常并提高DIO小鼠的血糖调节能力。
我们发现，口服D3可使DIO小鼠的体重增加减少12.06%±2.35%，并改善肠道菌群失调。我们进一步证明，D3可以上调UGN和瘦素抵抗的表达，这两者都可以抑制小鼠的食欲。我们的研究提供了一个新的观点和证据，表明来自蛋白质前体降解片段的内源性多肽可能在调节肥胖和其他代谢性疾病中发挥重要作用(图5l)。 迄今为止，五种药物(奥利司他、芬特明和托吡酯、纳曲酮＋安非他酮、利拉鲁肽和索马鲁肽)均具有厌食作用，已被美国食品和药物管理局(FDA)批准用于成人的长期体重管理。在本研究中，我们发现D3处理后，SPF小鼠和GF小鼠的食物摄入量均显著降低，同时小肠中UGN的表达增加。UGN是一种由小肠肠嗜铬细胞分泌的16个氨基酸的厌食激素，已被证明可靶向下丘脑的GUCY2C受体，并通过血液循环激活厌食症产生的途径。静脉注射尿鸟苷前体激素可引起小鼠饱腹感。Kim等人还发现，受脑特异性启动子控制的转基因UGN可产生生理水平以诱导持久的厌食反应，对抗体重增加至少24周而不改变DIO小鼠的代谢率。 我们发现，D3治疗可以通过上调UGN的表达和提高血清中UGN的含量来抵抗饮食诱导的小鼠肥胖的发生和恶化。这种UGN(肠道)-GUCY2C(下丘脑)内分泌轴有可能成为食欲控制和代谢综合征的新治疗靶点。
此外，我们发现D3恢复了由HF饮食引起的代偿性瘦素升高并增加了瘦素敏感性。瘦素可以通过抑制ARC中神经元的活动来降低食欲，ARC是下丘脑食欲调节的中心。当ARC中神经元被饥饿激活时，会发生c-Fos表达的显著诱导，这可以通过食欲抑制剂(如雌二醇和瘦素)或进食来逆转。值得注意的是，D3给药后小鼠c-Fos表达上调并与表达POMC的神经元共定位，可能是由于D3促进UGN表达和其作为瘦素敏化剂的综合作用。 目前，越来越多的证据表明肠道菌群在各种代谢疾病中的作用，对肠道菌群的操纵可能是一种新的治疗选择。
在本研究中，我们发现D3处理可以降低Desulfovibrio 和Ruminococcus 的丰度。向GF小鼠施用Desulfovibrio后，小鼠体脂百分比和CD36表达增加，CD36是哺乳动物体内脂质吸收和稳态的关键调节因子。此外，我们在D3处理的小鼠中观察到较高丰度的拟杆菌(Bacteroides)。许多观察性和干预性研究已将瘦身或体重减轻与拟杆菌(Bacteroidetes)水平升高相关联，拟杆菌可产生短链脂肪酸。但这种关系是有争议的，因为观察性研究还发现拟杆菌的丰度增加与西方饮食有关，而西方饮食与肥胖有关。在本研究中，我们发现用B. vulgatus进行4周的定殖并未导致DIO小鼠体重的显著变化。相比之下，在肥胖小鼠体内移植A. muciniphila 可逆转肥胖表型，这与之前的研究一致。值得注意的是，D3处理的GF小鼠(9.14%±2.93%)和SPF小鼠(12.06%±2.35%)体重减轻百分比之间的差异进一步证明了肠道菌群在治疗肥胖中的作用。事实上，许多被发现可以减轻体重的药物和化学物质都会影响肠道微生物群。例如，利拉鲁肽改变了整体组成以及与体重相关的系统发育型的相对丰度，例如处理过的DIO小鼠中Proteobacteria 的减少和A. muciniphila 的增加。有趣的是，D3处理使A. muciniphila 的丰度增加了100倍，这种效果比前两种药物(3~5倍)强很多。 许多多肽已被用作调节神经内分泌系统以预防肥胖的信号分子，包括利拉鲁肽和索马鲁肽、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)激动剂和肾上腺髓质素2。然而，有几个原因可以解释注射GLP-1R激动剂的缓慢采用，包括该患者群体对注射疗法的依从性差，以及与注射疗法相比，患者一般更喜欢口服药物。值得注意的是，在本研究中，口服D3显著降低了小鼠的体重，表明D3有可能成为治疗肥胖症的一种有效的首选治疗方案。由于安全问题，肥胖药物的使用一直受到限制。目前FDA批准用于临床治疗肥胖症的药物中，似乎大部分都有副作用。例如，GLP-1类似物已被证明会引起副作用，包括短暂性恶心、GLP-1RA相关或胰岛素胃肠道副作用急性胰腺炎、呕吐和食欲不振，从而限制了剂量。值得注意的是，在我们对小鼠、大鼠或猕猴的研究中，没有观察到D3的明显副作用。考虑到本研究实验只进行了10-12周，还需要更长的实验周期来验证结果。
综上所述，我们在此报告了一种小肽D3(不是GLP-1类似物)，可以通过抑制食欲和调节肠道微生物群来抑制肥胖的发展。本研究增加了新的证据，表明UGN-GUCY2G轴是抗肥胖药物开发的一个潜在治疗靶点，并支持D3是对抗饮食诱导的肥胖的竞争性候选药物，具有良好的安全性。该肽在人体中的潜在多效性作用仍需在未来的研究中加以探讨。