作者：杜伟丽，赵颖丽，王冲，董宇杰，屈晓蝶，刘子臣，李琨，车南颖

第一作者及单位：杜伟丽，首都医科大学附属北京胸科医院/北京市结核病胸部肿瘤研究所

通信作者及单位：车南颖，首都医科大学附属北京胸科医院/北京市结核病胸部肿瘤研究所

Spatial bacterial subpopulations of a human lung lobe and their potential impact on the progression of pulmonary tuberculosis

Du W, Zhao Y, Wang C, Dong Y, Qu X, Liu Z, Li K, Che N.

Microb Pathog, 2022, 169: 105656.

doi: 10.1016/j.micpath.2022.105656.

PMID: 35777521.

研究背景

结核病由结核分枝杆菌（Mycobacterium bacterium, MTB）感染引起，发病率和死亡率均较高，严重威胁人类健康。很多研究表明，除了宿主自身免疫对MTB的抵抗外，肺部固有菌群也可以通过调节机体免疫细胞来抑制MTB在肺部定植和疾病的发展过程。肺是一个有着复杂解剖结构的器官，不同部位生理生化指标差异较大，在肺部形成不同的微生态环境，对肺部菌群造成不同的选择压力。对肺结核而言，MTB在肺某些部位容易定植，而在其他部位生长却受到抑制。因此，我们检测了肺不同解剖部位菌群的组成特征，探讨了它们对肺结核病灶病理形态发生、发展的潜在影响。

研究方法

1.临床样本：研究纳入接受右肺上叶手术切除治疗的肺结核患者1例。该患者为男性，31岁，异烟肼耐药，无免疫缺陷疾病，常规取材后剩余的标本用于研究不同取材部位的菌群结构。该大体标本有2个界限分明的坏死病灶，我们对该大体标本不同部位进行取样，共得到34份标本，其中23份为正常组织，11份为病变组织。每份标本以ZZabcd的形式命名，其中ZZ指患者，ab指取材层数，cd指具体某一层的具体部位（图1）。

图1  A：结核病患者右肺上叶模式图。从上到下共获得10个切面层；B～K：1～10层切面上不同的取材位点

2.细菌16S rRNA扩增和测序：提取组织样本中的核酸，采用515F/806R对样本中细菌16S rRNA V4可变区进行扩增，扩增产物在2%琼脂糖凝胶进行电泳检测。扩增产物经Qubit 4.0定量、Agilent 2100质控后，构建DNA文库，加接头和barcode，在Illumina MiSeq PE 250平台进行测序。

3.16S rRNA高通量数据分析：下机后的细菌16S rRNA高通量数据在QIIME v1.9平台上进行质控，叶绿体、线粒体和嵌合体的去除，以及后续的基础分析，包括OTU（operational taxonomic units）聚类、α多样性和β多样性的计算等。肺结核患者不同取材部位菌群的代谢功能在PICRUSt平台上完成预测。

研究结果

1. 不同取材部位菌群特征：该肺结核患者右肺上叶病变组织和正常组织，以及两个独立病灶之间菌群的Chao 1指数和Shannon指数差异均无统计学意义（图2A）。在肺结核患者肺部，Proteobacterium 是最主要的门，占比达67.03～99.99%；此外，还检测到了Firmicutes，Actinobacteria和Bacteroidetes（图2B）。在属水平上，Ralstonia，Achromobacter和Pseudomonas相对丰度最高，占比合计为34.02%，但没有序列比对到Mycobacterium上。虽然病变组织和正常组织之间的菌群结构差异无统计学意义，但两个病灶中的菌群组成差异有统计学意义（ANOSIM，P=0.009）（图2C）。

图2  A：正常组织和病灶中菌群Chao 1指数和Shannon指数；B：门水平微生物组成柱状图；C：PCoA排序分析

2.不同取材部位特异的OTU：从34份肺组织样本中共检测到270个OTU，正常组织中有256个，高于病灶1（171个）和病灶2（172个）。将仅存在于某一个取材位点，且相对丰度>1%的OTU定义为特异OTU。特异的OTU代表能准确适应肺部某些解剖部位的菌群，具有指示菌的特征，这些菌群可提示右肺上叶不同生理生化特征的微生态位。虽然该肺结核患者右肺上叶不同取材部位菌群结构差异无统计学意义，但在一些取材位点上我们发现了特异的OTU类群（图3A）。对这些特异的OTU构建系统发育树，共得到5个类群，分别是Alphaproteobacteria，Gammaproteobacteria，Betaproteobacteria，Bacteroidetes和Firmicutes（图3B）。值得注意的是，隶属于Firmicutes的类群主要分布在正常组织中。有研究表明，Firmicutes与肺功能呈正相关，有利于维持肺部健康。

图3   A：取材位点中检测到的特异OTU。圆圈直径大小（从内到外）代表OTU（从上到下）相对丰度的高低。标星号的位点代指病灶组织。B：A中所有特异OTU构建系统发育树。黑色标记的为正常组织中的特异OTU，红色标记的为病灶中的特异OTU

3.肺部菌群代谢特征：我们在PICRUSt平台上对肺部菌群的代谢功能进行预测，共得到381条细菌代谢途径（图4A），这些代谢途径主要与TCA循环、外界环境交流、遗传信息处理等功能相关，它们广泛存在于各种不同的细菌类群中。正常组织和病灶之间没有发现差异显著的细菌代谢途径，但在两个病灶中预测到了4个有显著差异的细菌代谢功能（图4B），它们分别与氮代谢、硫氧化、芳香胺降解和酚醛降解相关。有研究表明，前两个细菌代谢功能直接影响宿主抵抗MTB的免疫状态。结合两个病灶的病理组织形态，病灶1临近气道并以肉芽肿性炎为主，而病灶2则远离气道并以坏死性病变为主，提示肺部固有菌群可能通过自身的代谢活动影响肺结核病灶病理形态的发生和发展过程。

图4  A：K-means热图展示预测到的381个细菌代谢通路。B：火山图展示两个病灶之间差异有统计学意义的细菌代谢通路

研究结论

本研究探讨了1例接受右肺上叶手术切除治疗的肺结核患者肺部不同取材部位的菌群特征，虽然菌群组成与肺的解剖部位没有显著相关性，但两个病灶中的菌群结构差异显著；此外，我们还发现了与肺解剖部位相关的特异细菌类群，认为肺部菌群可能通过自身的代谢活动参与并影响肺结核病灶的发生发展过程。

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供稿：杜伟丽

编辑：孟    莉 

审校：范永德

发布日期：2022-07-28

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