本期跟大家分享一篇于2017年4月8日发表在《临床检验杂志》上的文章——《HCV RNA阳性标本PCR-荧光探针法病毒亚型未检出原因分析》。该研究采用Sanger测序法进行基因型分析，探究了血清HCV RNA阳性，但PCR-荧光探针法病毒亚型检测未检出的原因。

HCV是一种有很高变异率的不均质病毒株，复制过程中所依赖的RNA多聚酶具有错配倾向。不同的HCV基因型其致病毒力、预后及其抗病毒难度治疗的反应性方面都有差异，因此检测HCV基因型对临床的治疗方案选择、预后评估具有重要意义。现有的HCV基因型检测试剂盒（PCR-荧光探针法）主要选取HCV的保守区域设计相应的特异性引物和探针，但临床存在HCV RNA阳性，基因分型未检测出的现象，给临床诊断和治疗带来极大困扰。针对该现象，本文章总结分析HCV病毒载量阳性，但基因型不能分辨现象的原因及该部分患者的临床特征。

收集2015年7月至2016年3月北京佑安医院临检中心分子室病毒载量>1000IU/mL，PCR-荧光探针法未测出病毒亚型的标本55例，采用Sanger测序法进行基因型分析；随机选取同时期HCV病毒载量>1000IU/mL，且PCR-荧光探针法病毒分型为1b亚型的标本50例作为对照组。

（1）测序结果分析：55例样本利用Sanger测序法均被成功检测亚型，其中3例为病毒载量接近病毒亚型检测下限，经测序分析为1b型2例，2a型1例；5例为检测试剂盒未覆盖亚型并且其探针位置无突变，HCV 1a型4例，6n型1例，占9. 1%( 5 /55) ；

47例因探针序列位置基因突变导致病毒亚型未检出，占85.5%( 47 /55) ，经测序发现其中1a型6例( 6 /47，12.8%) ，1b型32例( 32 /47，68.1%) ，2a型3例( 3 /47，6.4%) ，2b 型1 例( 1 /47，2. 1%) ，3b型1例( 1 /47，2.1%)，6a型2例( 2 /47，4.3%) ，1b、6q、6c 混合型1例( 1 /47，2.1%) ，6n型1例( 1 /47，2.1%)。见表1：  

（2）HCV探针序列位置基因变异情况分析：47例突变组中以HCV病毒5’非翻译区（5’UTR)204C/T突变为主（31/47,66%),其次为5’UTR 168C/A(5/47,10.6%)、5’UTR 214A/T(2/47,4.3%)等。

（3）HCV 1b基因突变型的临床特征：1b型5’UTR变异组与无变异组患者ALT、AST水平比较无统计学意义，但病毒载量的lg值分别为5.7±1.3、6.6±0.5，差异具有统计学意义（P=0.02)。

讨论：

（1）根据测序结果我们发现病毒载量低，试剂盒覆盖的病毒亚型有限，探针对应的序列存在变异均会影响PCR—荧光探针法检测HCV 基因型，其中探针序列变异是病毒亚型未测出的主要原因。

（2）目前HCV基因分型选择的区域有5’UTR、NS5、Core和包膜E1 区(core- Genvelope1 region,E1)，5’UTR 是HCV 基因组中高度保守区域，具有良好的多态性，可用于区分基因型但不能很好地区分亚型，尤其对于1型和6型这两种型别相似度较高的，可将一些6型的样本错分为1a或1b型[1]；NS5b区差异度较高，可达到16.5~20.1%，能准确区分HCV基因亚型甚至同一基因亚型内的不同分离株，但是检测的灵敏度欠佳[2]；包膜E1区是HCV 基因组的高度变异区，对于种属的区别意义较高，其核苷酸变异相对较大，相较于5’UTR具有更大的变异度，因此在基因分型方面的价值相对更高[3]。

（3）HCV基因分型的方法较多，直接测序法是其中研究较多,且最为经验的一类检测方法，是公认的“金标准”，可检测出多种基因型和基因亚型并同时可获得RASs结果的方法，是《丙型肝炎防治指南（2019年版）》唯一推荐的方法学[4]。

（4）鉴于HCV 分型对于丙型肝炎患者预后及治疗效果的影响较大，因此在进行治疗前尤其重视HCV基因型和亚型的区分，有助于临床制定最优化的DAAs 联合治疗方案以及最大限度地避免RAVs 导致的病毒学治疗失败，既提升治疗安全性又降低患者的经济负担，实现较佳的治疗目的。

参考文献

1.Laperche ,Lunel F,Izopet J,et al．Comparison of hepatitis C virus NS5b and 5’noncoding gene sequencing methods in a multi- centerstudy[J]．J Clin Microbiol,2005,43(5):733-739.

2.黄辉红,周元平.HCV基因型和亚型:分型技术、临床意义及其流行病学研究［D］广州:南方医科大学，2010．

3.耿田. 丙型肝炎病毒基因分型的检测方法及临床意义[J]. 海南医学院学报(16 期):1925-1928.

4.丙型肝炎防治指南（2019年版）.

通讯作者

赵艳

首都医科大学附属北京佑安医院临床检验中心副主任，2020年9月29日，被中共北京市委、北京市人民政府表彰为：“北京市抗击新冠肺炎疫情先进个人”荣誉称号。2017-2019 学科带头人承担北京市医管局“杨帆计划”重点医学专科一项；2013-2016申请人作为项目第二负责人，参与国家自然基金项目一项：人类免疫缺陷病毒与丙型肝炎病毒共感染加剧丙肝病程进展的机制研究，负责CTL克隆培养及相关功能研究；2012-2014年作为课题负责人，承担国家自然基金青年基金一项；2012-2014年作为课题负责人,承担首都发展基金一项。2009年作为科研骨干，参与“十一五”传染病重大专项“传染病临床免疫学研究及其技术支撑平台”，负责完成细胞免疫技术的平台建设。

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