Checkmate227研究最早在ClinicalTrial.gov上注册是2015-6-23，第一例病人入组是2015-8-5。Checkmate 227研究启动时， Checkmate-017¹和Checkmate-057²两个三期RCT 已经证明了Nivolumab在NSCLC二线治疗的的成功。同时，Nivolumab单药用于NSCLC一线的Checkmate-026研究³还在进行中。竞争对手Pembrolizumab的二线单药三期研究KEYNOTE-010研究⁴结果还未公布，单药一线三期的KEYNOTE-024研究⁵还在进行中。因此在CheckMate-227研究设计之初，Nivo风头正盛，BMS应当也是信心满满。最初版本的CheckMate-227研究方案跟现在方案的主要研究目的已经大相径庭，未变的是入组人群还是分为PD-L1+（≥1%）和PD-L1-（＜1%）两组，PD-L1+患者随机分配到Nivo+Ipili, Nivo,以及Chemo组。PD-L1-患者随机分配到Nivo+Ipili, Nivo+Chemo,以及Chemo。设计如下图所示：

在CheckMate-227最初的方案里面，有两个主要部分：PD-L1+和PD-L-组，,两部分之间没有联合分析的计划，也没有共享α。类似于同时进行的两个独立的RCT，两个RCT在一个Protocol下进行，但是结果和结论互不影响。在两个部分，主要研究终点都是PFS和OS。在PD-L1+组目的是比较 Nivo+Ipli vs Chemo和 Nivo vs Chemo。在PD-L-组目的是比较Nivo+Ipli vs Chemo和Nivo+Chemo vs Chemo。因此在PD-L+和PD-L1-部分都同时存在2*2=4个主要研究假设，理论上讲，只要四个研究假设有一个达到统计学上的显著性，该部分都可以宣称在统计学上达到了阳性结果。于此相对应的是，研究者需要针对这四个研究假设分别计算样本量，并且合理分配α值，保证每个部分总体α值在0.05的水平。

PD-L1+部分的样本量计算依据如下

从上表我们可以看出，PD-L1+部分的0.05的α是这样分配的，PFS和OS各分得0.01和0.04，然后在两个试验组之间继续拆分。具体如下图所示：

PD-L1-部分的设计和样本量计算跟PD-L1-部分几乎完全一致，其样本量计算依据如下

PD-L-部分的α分配方案如下

在CheckMAte-227CheckMate-227最初的方案里面，所有入组人群都被纳入到主要分析中，研发者目希望在所有人群拿到适应症的审批。PD-L1+和PD-L1-两个人群部分，类似两个独立的同时进行的RCT，两者没有共享α。无论在PD-L1+还是PD-L1-人群，两个试验组之间是平分α的，显示研究者并未对两个试验组中的一个有任何倾向性。

2016年ESMO会议，Checkmate026研究³和Keynote-024研究⁵结果同时公布，悲喜两重天，BMS在天王山之战中失败，Nivo单药饮恨NSCLC一线治疗。Checkmate026研究结果很显然对在进行中的Checkmate-227研究产生了重大影响，BMS在2016-11-4对研究方案进行了重大修改。首先是引入了CheckMate-227 Part 2，Part2的目的是:在不限制PD-L1表达水平的人群中，比较Nivo+Chemo vs Chemo。原来的CheckMate-227方案变成Part1。Part1包含PD-L1+部分（Part 1A）和PD-L1-部分(Part 1B)。 

Part1A 的研究目标为

• 主要目标

– 在PD L1≥ 50%人群比较 Nivo+Ipilimumab VS Chemo的OS

• 次要目标

– 在PD L1≥ 1%人群比较 Nivo+Ipilimumab VS Chemo的OS

–  在PD L1≥ 50%人群比较 Nivo VS Chemo的OS

– 在PD L1≥ 1%人群比较 Nivo VS Chemo的OS

•  样本量: 从990增加到1200

• 研究者抛弃了PFS和OS的双主要研究终点设计，选择OS作为单一主要研究终点

• 在PD-L1+人群，基于CheckMate-026研究的结果，Nivo单药基本被放弃，Nivo+Ipli成为最重要的试验组

• 研究者放弃了在PD-L1+总体人群验证Nivo+Ipli疗效的努力，而是跟KeyNote-024研究一样将主要人群变为PD-L1≥50%

•  选择PD-L1≥50%作为唯一主要研究终点，只有不到40%的入组患者纳入到主要分析中，其余800人的数据不能帮助提供确证性结论，是极大的浪费。完全可以把PD-L1>1%人群作为第二个主要研究终点，采用hierarchical设计，类似KEYNOTE-042研究。而这样的设计几乎不会额外增加任何成本

• PD-L1>50%并不是一个分层因素，试验组和对照组之间的基线均衡性受到一定威胁

Part1B 的研究目标为

• 主要目标

–      在PD-L1-人群比较Nivo+Chemo vs Chemo 的PFS(BICR评估)

• 次要目标

–      在PD-L1-人群比较Nivo+Ipili vs Chemo 的PFS(BICR评估)

–      在PD-L1-人群比较Nivo+Ipili vs Chemo 的OS

–      在PD-L1-人群比较Nivo+Chemo vs Chemo 的OS

•  PD-L1-人群所需样本量从990减少到540

• 研究者抛弃了PFS和OS的双主要研究终点设计，选择PFS作为单一主要研究终点

• 在样本量计算时研究者对PFS HR的估计更加乐观，从0.715变为0.66，HR的界值从0.783提高到0.778

• 在PD-L1-人群，研究者在Nivo+Chemo和Nivo+Ipli之间选择了前者，作为最重要的试验组

• 对免疫治疗来说, PFS相比于OS并不一定是一个更容易达到的研究终点，采用先PFS后OS的顺序是有风险的

• 对没有靶向基因驱动的NSCLC来说，生存期较短，提高总生存仍然是最重要的目标

• 本研究试验组是O药+化疗(O药--Opdivo是nivolumab的商品名)，而不是O药单药，毒性和经济成本相比于单纯化疗都会增加，生活质量也很难有优势，单靠PFS获益很难获批，特别是在竞品具有OS获益的情况下

• 即使将OS作为次要研究终点，也应该计算样本量，保证足够的Power

• 在PD-L1-组选择选择Nivo+Chemo作为主要试验组，缺乏依据，特别是在增加了Part 2 的情况下(Part2 的目的是在不限制PD-L1表达水平的人群中，比较Nivo+Chemovs Chemo)，Part1应该更关注Nivo+Ipili这一组合

2017年6月CheckMate-026研究³的结果正式发表在NEJM上，除了主要研究结果外，研究者还报道了基于TMB的亚组分析结果。对于高TMB患者，O药单药可以显著延长患者的PFS（HR=0.62），对于中低TMB的患者，接受O药治疗的患者的PFS显著劣于接受化疗的患者（HR=1.82）

但是这只是探索性亚组分析的结果，需要前瞻性研究进行验证。因此研究者再一次改变了CheckMate-227研究的方案，引入了TMB分析。整个CheckMate-227研究分成了3大部分：Part1A (基于PD-L1的分析, 包含了原有的PD-L1+和PD-L1- 亚组)，Part1B（基于TMB的分析, 也是基于原有的PD-L1+和PD-L1- 亚组, 但只包含了部分患者,具体信息见下图）。以及另外开展的Part 2（在不限制PD-L1表达人群中比较Nivo+Chemovs Chemo ）。

CheckMate227 Part 1A方案如下图所示

CheckMatePart 1B方案如下

最终Part1统计分析计划如下

• 虽然是Independent co-primary endpoints，但是分析人群有重合. 因此CheckMate-227研究Part 1的A, B两个部分必须分享同一个0.05的α，而不同于之前的Part1A和Part1B可以分别使用一个0.05的α。

• 原有的Part 1A的主要目标是在PD L1≥ 50%人群比较 Nivo+Ipilimumab VS Chemo的OS, 而现在研究者放弃了PD-L1≥50%的人群筛选标准,重新回到PD-L1≥1%人群。

• 原有的Part 1 B的主要研究终点变为Part 1 A的次要研究终点。

• TMB成为与PD-L1表达水平同等重要的Biomarker，CheckMate-227研究Part 1B分得0.025 的α。

• 需要读者特别注意的是PD-L1<1%部分，Nivo+Ipili vs Chem的OS，这一终点在Checkmate 227 Part 1 A的分析计划里面的地位，不属于主要研究终点，甚至不是次要研究终点，只能归为第三等级的探索性研究终点，在第三等级里面也只能排在第四位，无论结果如何，都不能得到确证性的结果。而Nivo+Chemo vs Chemo是次要研究终点，有参与到α的分配，有机会得到确证性的结果。

• 在已经有Checkmate 227 part 2研究方案（Nivo+Chemo vs Chemo）的情况下，为何还在PD-L1-人群中，将Nivo+Ipili vs Chemo的重要性放在Nivo+Chemo vs Chemo之后，只做描述性分析？

• 基于CheckMate227 Part 1A中PD-L1-亚组的样本量，在60%数据成熟度的情况下Nivo+Chemo vs Chemo想要做出OS的统计学差异，需要HR＜0.737，而在CheckMate 227 Part 2 中，在60%数据成熟度的情况下Nivo+Chemo vs Chemo想要做出OS的统计学差异，只需要HR＜0.832，因此CheckMate227 Part 2的存在，使得CheckMate227 Part 1A中PD-L1-亚组的Nivo+Chemo vs Chemo的比较显得多余，而且浪费了PD-L1-亚组中， Nivo+Ipili VS Chemo得到确证性结果的机会。

• TMB作为Biomarker的证据不够充分，特别是与OS的关系

• OS列为次要研究终点，且没有根据OS计算样本量，对于OS不能下确证性的结论

• TMB的分析是在整个研究入组结束之后才引入的，TMB并不是分层因素，也不是基线变量，随机的完整性存在问题 

CheckMate-026研究基于TMB的探索性亚组分析表明在高表达组，Nivo相比于化疗，并没有生存优势。TMB高表达和低表达组的OS结果见下图

当时唯一公布的Nivo+Ipili的三期RCT只有在黑色素瘤一线的CheckMate-067研究中，在该研究中TMB水平跟Nivo+Ipli的疗效没有相关性

但是从BMS当时面临的竞争压力来看，他们押注TMB是有一定理由的。KEYNOTE-024研究以及KEYNOTE-021G研究的结果，Pembrolizmuab单药在高表达人群以及Pembrolizumab+Chemo在不限制PD-L1表达人群中显示出了非常突出的疗效，PFS的HR在0.5左右，所以CheckMate-227研究不仅要赢，还要赢的非常漂亮，在市场上才会有竞争力，只在HR=0.7左右的水平上得到一个阳性结果，即使获批，市场前景也有限。而PD-L1表达水平对于Nivo来说并不是一个Biomarker，因此BMS急需一个好的Biomarker来筛选出最佳获益人群。虽然TMB不完美，但是伸头是一刀，缩头也是一刀，BMS也只能硬上了。但是BMS在CheckMate-227Part1研究设计上最大的失误不是引入TMB，而是在引入TMB之后，在CheckMate-227Part1A部分没能正确选择在PD-L1-亚组更具有研究价值的治疗组Nivo+Ipili。

Checkmate227 Part 1B TMB 的PFS结果2018年四月份发表在NEJM。对于TMB高表达的患者，虽然两组中位PFS差距不大，分别是7.2个月和5.5个月，但是Nivo+Ipili组的1年PFS率是42.6%，而化疗组1年PFS率是13.2%，疾病进展和死亡的风险下降了42%（HR=0.58）。但是当时研究者没有报道OS结果。后续的报道显示，虽然Nivo+Ipli显著提高了TMB高表达患者的PFS，但是PFS的获益没有完全转化成OS获益。在TMB高表达组：中位OS分别是23.03months versus 16.72 months (HR, 0.77; 95% CI, 0.56-1.06)；低表达组：16.20 months versus 12.42 months,(HR, 0.78; 95% CI, 0.61-1.00)。显示TMB并不是Nivo+Ipili的OS获益的预测因素。BMS最终撤回了基于CheckMate-227研究TMB结果上市的申请。

飞哥列出了Part 1A部分的6个重要的研究结果（序号1-6）。1是主要研究结果，2-4是次要研究结果，5和6是大家目前谈论比较多的，但是其实在Protocol里面只是作为描述性分析的结果。5，也就是Nivo+Ipilivs Chemo在PD-L1-人群的OS结果，在研究方案里面既没有计算样本量也没有分配α，甚至没有计划进行两组间的比较。而6，则压根没有计划进行分析，只能是Post-hoc的结果。如果不是5，6的结果是有“统计学差异的”，这两个结果只会被放在附件里。而现在5，6个结果成了主要研究结果之一，放在正文里面，但是即使放在了正文中，研究者也不能报道P值，也不具有统计学意义。

• TMB最终被证明不能预测OS的获益，加之TMB高表达人群数目过少，导致OS结果没有统计学差异

• Nivo+Ipili vs Chemo可以显著提高PD-L1≥1%患者的OS

• Nivo+Ipili vs Chemo在PD-L1<1患者的结果只能作为探索性，描述性分析的结果

• 如果研究者在CheckMate-227 Part 1 专注于Nivo+Iplili vs Chemo的疗效，而且采用先PD-L1+再总体人群的策略或者先PD-L1+再PD-L1-的策略，本来可以得到一个Nivo+Iplili在总体人群可以显著延长OS的确证性的结果。  这就好比小明去参加考试，一共考语数外加政史地和物化生九门，但是只计算六门的成绩，需要考前选好，一旦选择就不能更改，小明选择了语数外和史地政，但是最终结果是物化生明显高于史地政，但是成绩已经无法更改。

• KEYNOTE-021G研究6结果2016-10-9发表在Lancet Oncol

• KEYNOTE-021G研究表明在non-SQ NSCLC，K药+chemovs Chemo可以显著提高患者的ORR和PFS，与PD-L1表达水平无关

• 而原有的CheckMate-227研究只在PD-L-部分有Nivo+Chemo的试验组，因此研究者在2016-11-4增加了Part 2，用来研究在不限制PD-L1表达水平人群中Nivo+Chemovs Chemo的效果

• 2018年KEYNOTE-1897和KEYNOTE-4078研究结果相继公布，并发表在NEJM,证明K药+chemo vs Chemo可以显著non-SQ NSCLC和SQ NSCLC的OS

CheckMate-227研究的Part 2可以看作一个相对独立的三期研究，因为Part2跟Part1之间并没有联合分析的计划，试验组和对照组都是独立的，因此Part1和Part2之间不需要共享α。CheckMate-227Part 2的样本量计算和统计分析计划如下图所示，CheckMate 227 Part2研究把主要研究终点定为了非鳞癌患者的OS，总体人群和鳞癌人群的OS只是描述性的结果，无论结果如何都不具有统计学意义。

• 将非鳞癌作为潜在优势人群的选择缺乏依据, Nivo本身的历史数据不支持这一推断。Nivo在NSCLC领域之前的三个大型RCT都提示Nivo对于鳞癌患者效果更好

• CheckMate-017

• Nivolumabversus Docetaxel 鳞癌二线治疗

•  N=272

•  HR=0.59;95% CI, 0.44 to 0.79

• CehckMate-057

• Nivolumabversus Docetaxel 非鳞癌二线治疗

• N=582

• HR=0.73;96% CI, 0.59 to 0.89

• CheckMate-026

• Nivolumabvs Chemotherapy  肺癌一线

• 鳞癌亚组, HR=0.82

• 非鳞癌亚组, HR=1.17

以上三个研究一致提示，鳞癌患者相比非鳞癌患者，从Nivo获益更加明显

• 研究只设立非鳞癌一个主要研究人群，在总体人群和鳞癌亚组都只做描述性分析，是对入组的鳞癌人群数据的浪费。

• CheckMate-227part 1非鳞癌入组543人，总体人群入组755人

• 主要研究终点在成熟度60%时进行分析，总体人群成熟度60%意味着450余例事件数。90% Power to detect an HR of 0.73among patients in all patients with 450 deaths

• 因此即使研究者认为Nivo在非鳞癌人群疗效更加突出，在CheckMate-227 part 2 研究也应该采用Hierarchical 的双主要研究终点：首先在非鳞癌人群进行分析，然后在总体人群中进行分析。这样设计几乎不增加任何额外成本。

• 更加合理的设计是首先在鳞癌人群中进行检验，然后在总体人群中进行检验，或者直接在总体人群中进行统计学检验

Part2 研究的结果如下图所示，在非鳞癌人群，HR=0.86，95%CI，0.69-1.08，P=0.1859。研究没有达到主要研究终点。在总体人群和鳞癌亚组的分析不能下任何确证性结论，只能作描述性的结果。在总体人群HR=0.81, 95%CI，0.67-0.97;在鳞癌亚组，HR=0.69, 95%CI，0.50-0.97。

目前Part2部分的完整Protocol还没发表，研究者为何选择非鳞癌作为主要研究人群以及方案本身发生过哪些修改还不得而知，也许研究者参考更多的是其竞争对手Pembrolizumab的联合疗法在肺癌一线治疗研究结果，即：KEYNOTE-189以及KEYNOTE-407的结果，这两个研究表明，虽然Pembrolizumab加化疗在鳞癌以及非鳞癌中都可以显著延长OS, 但是在非鳞癌似乎更加有效（0.49 vs 0.64）。但是Checkmate026 和Keynote-024的结果已经清楚表明，此PD-1非彼PD-1，两个药物是有很大不同的。在自己的临床研究ChcekMate-017,ChcekMate-017以及ChcekMate-026一致提示Nivo在鳞癌人群可能更加有效的情况下，研究者在CheckMate-227研究中将非鳞癌作为唯一的主要研究人群毫无疑问是导致CheckMate-227研究 Part2失败的主要原因。

TMB这一Biomarker的引入一度给CheckMate-227研究带来了希望，但是OS的阴性结果使得在PFS上的显著获益失去了意义。虽然TMB部分未能成功，但是如果能调整适当，研究者仍有机会在PD-L1部分做出全人群的阳性结果。但是研究者在Part1A和Part 2部分都未没能筛选出最优人群，两次踏进同一条河流，导致研究结果不尽人意。在CheckMate-227 Part 2失败后， CheckMate 9LA研究（Nivo+Ipili+Chemo vs Chemo）成了Nivo获得NSCLC一线全人群适应症的最后希望，而BMS也在最近宣布该研究在期中分析中达到主要研究终点，提前终止。因期中分析提前终止也不意味着疗效会特别突出，CheckMate 9LA研究入组了700例患者，假如同CheckMate-227Part1一样在数据成熟度60%时进行主要分析，70%事件数时进行期中分析（根据ClincalTrial.gov上显示的主要分析的时间以及BMS公布期中分析结果的时间推断，差不多是在70%）,CheckMate 9LA研究达到阳性结果的OS的HR界值是0.752（假如是在75%事件数进行期中分析，HR界值是0.768）。实际结果需要等研究者公布后才能知道，但是作为一个四药联合方案，如果在疗效上不能压倒三药方案的话，即使获批，市场前景也不乐观。

感谢丁云鹏博士对本文的校订和修改！对本研究的解读仅代表个人观点，不代表任何单位和团体，也不构成任何治疗建议。本文的撰写未接受任何资助。