T淋巴细胞对抗原的细胞毒性作用已经被用来攻克癌症，在肿瘤治疗中已经成为了研究热点。T细胞相关的基础科学知识已经从分子和细胞生物学角度被越来越多的研究所发现，也因此而产生了很多新的方法与肿瘤作斗争，其中包括免疫检查点，过继细胞疗法和肿瘤疫苗。
在2020年5月20日一篇发表在 Nature Reviews Immunology（IF：44.02）期刊的综述中，着重强调了T细胞在现代癌症免疫治疗中的作用，并讨论了三种不同的肿瘤免疫疗法：免疫检查点抑制剂，过继性细胞疗法和癌症疫苗。在本篇文章中我们先来看看免疫检查点抑制剂的相关内容，一种重启T细胞免疫活力的方法。
T细胞上行是免疫抑制作用的受体，也就是我们通常说的免疫“刹车”作用，这些位点可以用来做“检查点分子”来调节免疫作用。细胞毒性T淋巴细胞抗原4（CTLA-4）和程序性细胞死亡受体1（PD-1）便是T细胞上研究中最多的免疫检查点分子。它们在T细胞的不同生命周期里进行表达并发挥生物学功能，是相互补充的，但又同时确保了T细胞的应答和保持自我的耐受性，进而有效的保护人体免受病原体侵害和肿瘤的形成。CTLA-4和PD-1已被多个研究小组成功用作治疗各种难治性癌症的研究对象，该研究最终为James P.Allison和Tasuku Honjo赢得了2018年诺贝尔生理学或医学奖。
CTLA-4生物学功能
在发现T细胞上免疫共刺激分子CD28后，研究学者们也同样发现了一个与CD28受体具有相似结构且生化功能相似的受体CTLA-4，进而被鉴定为新的免疫球蛋白超家族成员。CTLA-4和CD28的基因被发现位于染色体的相同位置（2q33.2）并在造血区域选择性表达。但是，与CD28在T细胞上的组成型高水平表达不同，CTLA-4通常在T细胞上的表达量较低，当被抗原激活时才会发生高水平诱导性表达。有趣的是，对于Treg细胞（CD4+CD25+）一种发挥免疫抑制作用的细胞，CTLA-4在其上确是组成型的表达。在结构上，CTLA-4和CD28 都具有形成膜结合的同型二聚体，其包含胞外区免疫球蛋白样的结构域，跨膜区和能募集信号蛋白并控制表面表达的胞质区。由于CTLA-4和CD28的胞外结合区具有相似的序列，因此它们均可以与抗原呈递细胞上的配体B7-1（或称CD80）和B7-2（或称CD86）进行结合。但是CTLA-4相较CD28与B7配体的结合的亲和力更高，这使得它们在生物学功能上存在了差异。随着对CD28和CTLA-4的进一步研究，两者的作用功能越来越清晰。它俩具有相反的免疫调节功能。例如，研究发现在含有可溶性CTLA-4的环境中培养T细胞和表达B7分子的APC细胞，CTLA-4可以与CD28发生竞争，进而与B7配体结合抑制T细胞的增殖。在体内，CTLA-4的负调节作用也同样存在。在敲除了CTLA-4的小鼠中会发生T细胞介导的淋巴增生性自身免疫性疾病。这种因缺乏CTLA-4引起的自身免疫性淋巴增生性疾病，主要是由于CD28的活性所导致。当小鼠模型中的CD28细胞内区域发生突变时，该疾病可以得到消除。另外，研究发现CTLA-4功能不全的人会表现出相似的严重多器官淋巴细胞浸润和自身免疫性疾病，可以通过FDA批准的CTLA4-Ig进行治疗。
除了在活化的常规T细胞中发挥功能外，Treg细胞上CTLA4的表达也有着直接和间接的免疫抑制功能。体外研究表明，CTLA4是Treg细胞释放抗炎细胞因子所必需的，可减少附近常规T细胞的多克隆激活和增殖。除了直接的免疫抑制作用外，Treg细胞还通过结合APC上的B7配体，将其内在化和降解的方式引发树突细胞诱导T细胞的活力丧失，该过程被称为反内吞作用。
CTLA-4抑制剂在癌症中的应用
CTLA-4作为T细胞抑制作用的调节分子，那么通过阻止CTLA-4的作用是否可以释放T细胞的活性来针对癌症的治疗呢？
研究者们通过在小鼠模型中加入抗CTLA-4的抗体，发现其对结肠癌和纤维肉瘤具有抗肿瘤的能力。另外研究发现通过CTLA-4抗体的加入能够快速清除免疫逃逸的肿瘤细胞，进一步证明阻断CTLA-4分子可以产生长效的免疫记忆功能。尽管以CTLA-4为单一靶点的疗法在脑，卵巢，膀胱，结肠，前列腺和软组织肿瘤中显示出了不错的疗效，但是对于免疫原性较低的癌肿却没有得到良好的应答。此外，癌症模型之间的异质性也会导致得到不一致结果。研究发现，较大的肿瘤负荷也会减弱对CTLA-4抗体治疗的应答情况，这是由于大的肿瘤会形成更强大的抗炎性肿瘤微环境所导致。尽管在临床研究中CTLA-4取得了喜忧参半的结果，但在针对黑色素瘤的治疗中是证明有效的。Ipilimumab是一种人源的IgG1κ抗CTLA-4的单克隆抗体药物，长期生存数据分析表明，接受Ipilimumab治疗的晚期黑色素瘤患者中有22%的患者可以获得3年甚至更长的生存时间。这种长期生存获益的分析已经证实，CTLA-4可以持久性的发挥免疫抗肿瘤的作用。但遗憾的是，与黑色素瘤相比，肾细胞癌，非小细胞肺癌，小细胞肺癌和前列腺癌的结果并不理想。Tremelimumab也是一种CTLA-4抑制剂，但抗体类型为IgG2，目前尚未获得FDA的批准，因为研究发现该药物并不会增加晚期黑色素瘤的存活率。据推测，这可能是由于它与Ipilimumab在结合动力学的差异以及抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）差异所导致的。CTLA-4介导的肿瘤消退机制是多效性的，但受T淋巴细胞的作用所统一。T细胞的应答效应对于CTLA-4靶向药物的治疗效果是必不可少的，因为在前期的动物模型中发现，T细胞的耗竭会消除其抗肿瘤作用。CTLA-4抑制剂增强了T细胞对新抗原的克隆反应，这预示着抗CTLA-4疗法具有良好的响应。除了增强效应T细胞的反应外，在小鼠模型中研究发现抗CTLA-4治疗还会通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性作用（ADCC）耗尽局部肿瘤内的Treg细胞，进而平衡了肿瘤免疫微环境中的抑制作用。但这种现象仍然需要在人类的癌症中得到进一步的研究证实。尽管CTLA-4抑制剂的加入可以促使效应T细胞和Treg细胞的协同作用进而增强抗肿瘤能力，但是这两种细胞在赋予临床疗效方面仍存在争议。总体而言，目前的数据表明，预测临床结局的最关键因素是效应T细胞与Treg细胞在肿瘤浸润区的比例。
PD-1/PD-L1的生物学功能
PD-1与CTLA-4相似，对免疫系统的过度活化起着抑制的作用。作为免疫球蛋白超家族中的一种1型跨膜糖蛋白，PD-1与CTLA-4和CD28分别具有20%和15%的氨基酸一致性。人类的PD-1在TCR受到刺激后会在T细胞上表达，并与组成型存在于APC上的PD-L1（也称B7-H1）和PD-L2（也称B7-DC）结合。动物试验表明，PD-1在对T细胞的调节上与CTLA-4具有很大的差别。在空间上，CTLA-4主要在淋巴器官内发挥其调节作用，而PD-1则倾向于在周围组织内局部调节T细胞活化，且在T细胞的活化过程中PD-1起作用较晚。总体而言，PD-1在维持T细胞对自身的免疫耐受方面发挥着独特的作用。研究发现，PD-1主要通过在效应T细胞和Treg细胞内的抑制性信号来发挥免疫抑制作用。这类信号主要是基于免疫受体酪氨酸的开关基序和免疫受体酪氨酸的抑制基序，通过募集磷酸酶进行去磷酸化来发挥作用。CTLA-4和PD-1都可以通过抑制蛋白激酶B的信号通路来减少葡萄糖的摄入和利用，前者主要通过PP2A来实现，后者主要通过减弱PI3K的活力来实现。与CTLA-4相比，PD-1通路对于控制效应分子的持续激活和增殖至关重要。当PD-1与其配体结合后，它可以诱导T细胞功能障碍，该现象称为T细胞耗竭。但是，在什么情况下PD-1是调节细胞的耗竭还是凋亡呢？这目前仍然是一个正在研究中的问题。除了调节常规的T细胞外，研究发现APC上的PD-L1还可以控制Treg细胞的分化和其免疫抑制的活性。但不幸的是肿瘤细胞恰恰利用了这些原理，通过上调自身的PD-L1蛋白来诱导T细胞的耗竭并同时产生促进肿瘤生长和侵袭的微环境。
PD-1/PD-L1对癌症的阻断
在临床前研究中，PD-1通路已经被证实可用于癌症的治疗。首先在动物模型中的结果显示，过表达PD-L1或PD-L2的癌细胞限制了CD8+T的细胞毒性作用及抗肿瘤反应，通过加入PD-1抑制剂可以恢复CD8+T细胞对肿瘤细胞的毒性作用以及限制肿瘤的转移。
在临床前的实验成功后，研究者们相继研发出了依赖于PD-1/PD-L1通路相关的单克隆抗体药物。在2010年，一项I期临床试验表明，PD-1抑制剂具有良好的耐受性和抗肿瘤反应。在2014年，人源化和完全人源化的抗PD-1单抗pembrolizumab和nivolumab（同为IgG4亚类）被FDA批准用于难治性且无法切除的黑色素瘤的治疗。在2015年，pembrolizumab被批准用于PD-L1阳性的非小细胞肺癌患者的治疗。随后pembrolizumab和nivolumab在越来越多的癌肿中被获批。与CTLA-4疗法相似，长期生存分析表明，PD-1阻断后，免疫介导的生存获益是持久的。并且，PD-1抑制剂显示出了比抗CTLA-4治疗更广泛的临床效果，但是其中的原因还尚不清楚。据推测，这种差异可能是由于PD-1/PD-L1通路是由肿瘤介导所发生的免疫逃逸，而CTLA-4却是人体所拥有的正常免疫调节通路。与此同时，PD-L1也被证明在多种癌症中可以作为有效治疗的特异性靶点。在2016年，第一个靶向PD-L1的人源化单克隆抗体atezolizumab（IgG1亚类）被批准用于治疗尿路上皮癌。此后该药物的适应症得到进一步的扩大。其他抗PD-L1的人类单克隆抗体还包括avelumab和durvalumab，已于2017年进入市场。因此，与PD-1抑制剂相似，对PD-L1的阻断已在难以治疗的癌症中显示了良好的效应。
免疫检查点强大的效应功能，可能会导致对自身组织的免疫攻击作用。对数据集进行荟萃分析发现，预计有15-90%的患者发生了与免疫相关的不良事件。在CTLA-4和PD-1/PD-L1抑制剂治疗中分别观察到有30%和15%的患者发生了需要干预的严重不良反应。常见的免疫毒性特征是初始T细胞的丢失和过度活跃的记忆T细胞的积累，这些T细胞会侵袭胃肠道和肺等周围器官，并引起炎症性损伤。其中角质化和非角质化的黏膜似乎最敏感，分别约有68%和40%的患者出现了瘙痒和黏膜炎。其中抗CTLA-4疗法更常见于胃肠道和大脑的毒性反应，而抗PD-1/PD-L1疗法的患者发生甲状腺功能减退，肝毒性和肺炎的风险较高。然而，随着免疫检查点治疗的适应症的数量增多以及治疗患者越来越多，在更多的器官发生副作用的情况也越来越多，同时免疫治疗的异质性响应也越来越明显。目前，已经开发了多种免疫相关的反应标准，以期更好地将患者对免疫检查点抑制剂的反应进行分类。这些标准很大的一个目的是为了区分PD-1或CTLA-4治疗所带来的假性进展。总而言之，免疫检查点抑制剂已经被证实具有会导致自身免疫毒性的发生，并伴有特定器官发生毒性的模式。因此，越来越多的研究开始通过修饰现有抗体和设计新的传递方式来改善免疫检查点抑制剂的副作用和临床响应。例如：对抗体进行pH敏感修饰，可以有效限制不良事件的发生以及提高临床反应结果。另外一些研究显示改变免疫检查点抑制剂局部给药的生物材料可以有效增强耐受性和提高抗肿瘤应答。总之，当前广泛的研究正在探索减少免疫检查点疗法相关毒性的同时增加多种肿瘤中的获益方法。除了从药物本身出发来降低生物毒性，对于预测免疫不良反应的生物标志物的研究也是十分火热。一项研究表明通过测量胆汁糖蛋白CEACAM1和细胞表面蛋白CD177表达的增加来衡量中性粒细胞的活化，与ipilimumab治疗所导致的胃肠道相关副作用有关。另外一些研究显示，无论受影响的器官如何，嗜酸性粒细胞的增加和促炎性细胞因子IL-17的释放均与毒性有关。总之，最美好的愿望是通过遗传学，生物化学或是代谢谱分析可以预筛查或快速检测出免疫检查点药物对个体可能发生的不良反应。由于癌症病发的多样性，异质性以及免疫疗法激动人心的进步。越来越多的新兴的免疫疗法被开发，以解决癌症发病机制和靶向的复杂性。
组合疗法
在免疫检查点抑制剂单一疗法取得临床成功之后，各种研究发现将具有不同作用机制的药物结合起来的联合疗法在各种癌症中的治疗成功率都有所提高。例如，FDA获批的ipilimumab和nivolumab联合治疗转移性黑色素瘤和晚期肾癌。但是，也正如预期的那样，联合免疫检查点的疗法也会增加药物引起的毒性反应。放射疗法与免疫检查点抑制剂结合是顽固性肿瘤的另一种治疗选择。从机理上讲，放疗在免疫调节的作用中是一把双刃剑，放疗通过暴露新抗原增强了抗肿瘤T细胞的多样性，但同时也通过诱导肿瘤细胞上的PD-L1表达减弱了免疫反应。因此，在临床前数据的基础上，放疗与PD-1/PD-L1抑制剂的组合代表了一种具有吸引力的协同组合。转移性癌症患者可能是这种联合用药的目标人群。总而言之，双重免疫检查点抑制剂以及放疗联合免疫检查点抑制剂的多重疗法显示了协同反应的光明前景，因为这些药物组合显示除了独特且互补的药效学。
免疫检查点的新目标
免疫检查点抑制剂在癌症中的良好效果，促使了越来越多的学者开始新型免疫靶点的研究。其中包括淋巴细胞活化基因3（LAG3），T细胞免疫球蛋白3（TIM3），T细胞活化V结构域免疫球蛋白抑制剂（VISTA），B7-H3和T细胞免疫球蛋白ITIM结构域（TIGIT）。LAG3是一种抑制性配体在活化的T细胞以及Treg细胞上表达，可以阻断CD4细胞上的MHCII类分子的接触点来降低T细胞的活化作用。它通过诱导细胞周期的停滞来防止T细胞的过度扩增。与PD-1一样，LAG3是T细胞衰竭的标志物，在浸润性免疫淋巴细胞上的表达情况预示着临床预后的结果可能较差。目前，已开发出了相关阻断药物，包括LAG3：Ig融合蛋白以及靶向LAG3单克隆抗体。TIM3也是T细胞反应的另一个负调节剂。与LAG3一样抑制细胞周期的进程。它的上调可能导致了PD-1药物的抗药性，使得联合治疗成为了提高PD-1抑制剂效果的强力选择。类似于TIM3，VISTA是显示出与当前免疫检查点抑制剂抗药性相关的另一种分子，并在小鼠模型中显示了与抗PD-1疗法的协同作用。B7-H3同样是一个对T细胞进行负调节的靶点分子。它在许多的肿瘤类型中都高度表达。在针对多种肿瘤类型的I期临床研究中，Enobituzumab（一种针对B7-H3的人源化单克隆抗体）可有效诱导抗肿瘤反应。另有TIGIT也是一种抑制T细胞过度活化的靶点，由于它在肿瘤浸润性淋巴细胞中更稳定的表达，使得其相比其它检查点分子更具特异性，也成为了更有吸引力的靶点。除了上述提到的这些抑制性的免疫检查点。刺激T细胞的共刺激受体，包括诱导型刺激物（ICOS），肿瘤坏死因子受体超家族成员4（TNFRSF4，也称CD34），肿瘤坏死因子受体超家族成员9（TNFRSF9，也称4-1BB）等，也实现了有效的免疫治疗作用。专注于T细胞的癌症免疫疗法已经成为抗癌武器中的强大工具。但是，这是经过了多年的基础科学发现和临床转化，才明确证明了免疫系统治疗癌症的能力。进一步研究T细胞和其他免疫细胞的调控功能，可能会让我们能够更好的增强这种方法的功能。在“难以治疗”的肿瘤中，免疫检查点抑制剂的临床结果远高于有效的化学疗法。尽管与免疫相关的不良反应很常见，但是这些免疫疗法比传统化疗耐受性更好。上述我们叙述的癌症免疫疗法的成功案例突显了基础学科研究与临床实践之间的内在联系。并且说明了建立在坚实的基础学科之上的从实验室到临床的转化，是一种攻克人类可怕疾病的有效方法。
参考文献
1. Waldman A D, Fritz J M, Lenardo M J. A guide to cancer immunotherapy: from T cell basic science to clinical practice [J]. Nature Reviews Immunology, 2020.2.
2. Fritz, J. M. & Lenardo, M. J. Development of immune checkpoint therapy for cancer[J]. Journal of Experimental Medicine, 2019.
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