前言

蛋白质-聚合物偶联物被广泛用作疾病治疗剂，具有较高的靶点特异性等优点，但其使用也面临着一些挑战：快速清除和低物理稳定性。目前FDA 批准的蛋白质偶联物均与聚 (乙二醇) (PEG) 共价连接。这些聚乙二醇化药物在血液中的半衰期更长，给药频率降低，这对患者来说是一个显着的优势。然而，PEG 有一些潜在的缺点需要替代品的开发，因此开发具有增强的药代动力学特性以及其他优势（例如改进的稳定性或可降解性）的聚合物对于推进蛋白质治疗领域非常重要。

1977 年，Abuchowski 及其同事通过使用三聚氯氰偶联剂首次证明了单甲氧基-PEG (mPEG) 与牛血清白蛋白 (BSA) 的结合；1990 年FDA 批准了世界上首个聚乙二醇修饰药物 Adagen；1995年和1998年又相继发展了ATRP和RAFT活性聚合；2002年FDA批准了美国安进公司研发的PEG-G-CSF注射液“Neulasta”上市（图1）。

总之蛋白质-聚合物偶联物因其高特异性、低脱靶性等优点在作为疾病治疗剂中发挥着举足轻重的作用，但蛋白质通过新陈代谢、排泄和其他途径在体内迅速清除或失活，增强蛋白质特性（例如药代动力学）的方法主要有两种：一是使用重组 DNA 技术替换氨基酸或创建融合蛋白；另外是合成聚合物的偶联物，其中最常见的例子是聚乙二醇（PEG）。然而合成蛋白质-聚合物偶联物并不总是那么简单，需要考虑多种因素：聚合物的选择、蛋白质靶点的选择、偶联化学的选择以及体外和体内共轭的表征。

图1 蛋白质-聚合物偶联物的发展历程  

聚合物的选择

PEG和PEG类似物

目前最广泛使用的聚合物是PEG，它不仅增加了结合蛋白的流体动力学半径，还有助于免疫原性蛋白逃避免疫系统。PEG基团具有生物相容性，可商购获得。然而，一些人已被证明会产生抗 PEG 抗体，因此这些患者体内的PEG 化蛋白可以更快地清除。例如，40% 接受 PEG 化尿酸酶治疗的患者产生了抗 PEG 抗体，并且抗体水平与治疗开始后 6 周左右发生的药物疗效丧失密切相关[1]。PEG 刷状聚合物不仅可以增强循环半衰期，也不会诱导抗 PEG 抗体反应。例如：聚（聚乙二醇甲基醚甲基丙烯酸酯）—p（PEGMA）是一种具有低聚乙二醇侧链的甲基丙烯酸酯聚合物，已用于多种蛋白质-聚合物偶联物。此外，带有PEG侧链的降冰片烯聚合物可以降低病毒衣壳颗粒的免疫原性，而聚( N- (2-羟丙基)甲基丙烯酰胺) (p(HPMA)) 是另一种水溶性和生物相容性聚合物，可用于增加体内半衰期，也没有相关的免疫原性。

刺激响应性聚合物

  除了改善药代动力学外，聚合物还可以赋予蛋白质新的特性，聚丙烯酰胺如聚( N-异丙基丙烯酰胺)(p(NIPAAm))具有较低的临界溶解温度(LCST)，可以使得聚合物随着温度升高而沉淀。另外还有pH 响应型离子聚合物的偶联物，比如聚丙烯酸和聚 ( N,N -二甲基氨基乙基甲基丙烯酸酯) (p(DMAEMA))。使用刺激响应性聚合物在疾病治疗可能会实现有趣的应用，例如热疗介导的癌症治疗，但应考虑潜在的毒性。  

仿生聚合物

  受天然分子启发的聚合物已被证明能有效地融合天然分子的理想特性以及合成聚合物的优点。天然二糖海藻糖聚合物可以将生物大分子稳定到极端条件下，仿生聚合物的另一个例子是肝素模拟聚合物，使用聚苯乙烯磺酸盐和聚乙烯基磺酸盐作为合成肝素模拟物可以稳定具有治疗伤口愈合潜力但非常不稳定的成纤维细胞生长因子 2 (FGF2)。  

可降解聚合物

不可降解聚合物可在体内积聚，有可能会对人体造成潜在的毒副作用，因此开发用于生物医学用途的可降解聚合物是非常必要的。环状乙烯酮缩醛 (CKA) 是一种单体，可通过自由基开环产生可水解降解的主链酯键，CKAs 可以与乙烯基单体共聚以产生可降解的聚合物。 还有一些其它的天然聚合物类似物，例如多肽和羟乙基淀粉（HES）。各种蛋白质已与合成多肽偶联，尽管这些多肽是稳定的，但它们可能在体内被蛋白酶降解，类似地，HES 在血浆中被α-淀粉酶降解，并且其偶联物已被广泛研究用于治疗用途。  

聚合物相关的其它事项

有关聚合物体外和体内毒理学测试是必要的，且毒性评估应尽早进行，因为在开发过程中出现的安全问题可能代价高昂。例如，虽然HES 的毒性经过了广泛的测试，但在单独使用 HES 作为血浆扩容剂期间仍在临床观察到了严重的副作用。聚合物与蛋白质结合的主要目的是增加其循环半衰期。由于肾滤过是主要的清除途径，较大的聚合物通常会增加半衰期，然而较大的聚合物将容易积聚，因为肾过滤量约为 30 至 50 kDa。因此，应该选择将蛋白质的循环半衰期提高到预期治疗所需水平的最小聚合物分子量。聚合物尺寸的大小也会对生物活性产生影响，较大的聚合物通常会产生具有较低生物活性的缀合物，这很可能是由于非特异性空间位阻。 聚合物选择的流程大概如下，首先，应确定聚合物的分子量。如果需要 30 kDa 或更大的聚合物，则需要使用可降解聚合物以尽量减少在体内的积聚；而较小的聚合物也可能受益于可降解性和更快地从体内清除。然后确定偶联物是否只需要延长半衰期。在这种情况下，市面上有多种PEG或PEG类似物均可以使用。对于长期使用的情况，应考虑能够降低免疫原性的聚合物，因为在患者一生中反复注射后，患者会形成针对 PEG 的抗体。   

选择合适的偶联化学

一般来说，与小分子偶联反应相比，聚合物与蛋白质的偶联面临着更多的空间和熵屏障。因此，常用的偶联方法需要效率很高，偶联化学的选择还需要考虑位点选择性、蛋白质上残基的可用性。

蛋白质上的反应基团

位点选择性偶联对保持足够的生物活性是非常必要的，通常，缀合位点应远离活性位点或结合基序，以最大限度地保持蛋白质活性。赖氨酸是蛋白质表面最丰富的氨基酸，并且通常是第一个尝试进行非选择性缀合的残基，ε-氨基需要中性至碱性 pH 值才能具有足够的亲核性 (p Ka ~ 10.5)，赖氨酸不常用于位点选择性缀合，通常需要处于暴露区域，且微环境（例如相邻赖氨酸的存在和局部电荷）会影响反应性。但一些活泼酯、还原性的胺等可以使得赖氨酸发生位点选择性偶联。Bernardes和同事发现丙烯酸磺酰酯可以选择性地修饰五种不同蛋白质中的单个赖氨酸。 半胱氨酸的高亲核性使其易于修饰，但游离半胱氨酸很少见，并且通常位于疏水口袋中。如果蛋白质工程工具很容易获得，则在所需位点安装半胱氨酸的氨基酸取代是位点选择性耦合的有效策略。二硫键存在于大多数蛋白质中，它们可以用来作为残基特异性结合位点。 N-末端胺的 p Ka (6-8) 比赖氨酸 (~10.5) 显着降低，选择性 N-末端修饰通常是 pH 依赖性的，N端的酶促标记也可以使用来自金黄色葡萄球菌的分选酶 A (SrtA) 来实现。C-末端羧酸根基团难以与侧链羧酸根 (Asp/Glu) 进行区分，因此可以在 C-末端安装了特定的氨基酸序列，用于通过天然化学连接或酶促连接进行偶联。虽然酪氨酸的利用率较低，但它是一种具有中等表面丰度 (4.8%) 的氨基酸，并且已经开发了几种偶联方法，如重氮偶联、PTAD偶联等。

聚合物上的反应基团

聚合物上的反应基团是与亲核基团如赖氨酸、半胱氨酸或酪氨酸残基反应的亲电子试剂，通常这些官能团位于聚合物链的一端。这些常见的反应基团有活化的酯和碳酸盐、醛类、胺反应性硫醇化试剂、Michael受体、二硫键交换、N-末端偶联、酪氨酸偶联。部分举例如下：N-羟基琥珀酰亚胺 (NHS)聚合物被广泛使用并且许多是可商购的。 然而，NHS 在中性 pH 值下会在几小时内快速水解，可能不适用于所有蛋白质偶联，在这种情况下，五氟苯基 (PFP) 酯可能会产生更有效的偶联。脂肪族和芳香族醛常用于还原胺化赖氨酸和未修饰的 N 末端。马来酰亚胺是半胱氨酸偶联最常用的试剂。它们具有非常快的反应动力学（当 pH 7.5 时为10 3 -10 4 M -1s -1），并且耦合物通常是稳定的，乙烯基砜也是常用的迈克尔受体，虽然它们的反应性略低于马来酰亚胺，但水解更稳定。重氮和曼尼希偶联是常用的酪氨酸偶联方法，4-phenyl-1,2,4-triazole-3,5-dione (PTAD) 可在较宽的 pH 范围（2 至10）内与酪氨酸快速反应。 

蛋白质-聚合物偶联物的表征

偶联物纯化

纯化蛋白质-聚合物偶联物通常来说相对困难，因为聚合物几乎总是过量使用，并且偶联效率通常低于 100%，因此混合物通常包含三种类型的大分子——蛋白质、聚合物和偶联物。对于非常小且稳定的蛋白质，可以使用高效液相色谱（HPLC）进行纯化，然而有机溶剂的使用和柱内的高压会使大多数蛋白质的三级结构变性。而分子排阻色谱 (SEC) 仅适用于一小部分偶联物，因为它最适合分离尺寸差异高于两倍的两种物质。其他色谱方法，如离子交换和疏水相互作用色谱通常是更好的选择，它们在临床上常用于蛋白质药物的生产。

共轭表征

偶联物的常用表征方法包括凝胶电泳、质谱、SEC 和动态光散射 (DLS)，没有一种方法是确定性的，应该使用多种方法进行表征。

偶联物的生物学评价

在纯化和表征后应测试偶联物的活性。蛋白质的体外活性测定可以从生长因子相关的细胞增殖测定到抗体的酶联免疫吸附测定 (ELISA)。接有聚合物的蛋白质的结构完整性也可以通过圆二色谱 (CD)、DLS（检查潜在的聚集）和ELISA 来检查。聚合物偶联后，蛋白质活性通常降低至约 20% 至 80%，活性通常随着分子量的增加而降低，并且与偶联位点相关。 如果蛋白质活性不佳，可以通过位点选择性结合来提高其活性。Heather D. Maynard组通过对胰岛素三个胺位点中的两个进行非特异性还原胺化，合成了一种胰岛素-海藻糖聚合物共轭物，可以明显改善了循环半衰期。然而，可能是由于非特异性偶联导致与游离胰岛素相比，该偶联物需要五倍的剂量才能在小鼠中实现血糖降低的效果。为了提高偶联物的活性，作者选择LysB29进行位点选择性偶联，在三个可能的缀合位点（GlyAl、PheB1 和 LysB29）中选择 LysB29 是因为 GlyAl 偶联物的生物活性显着低于其他缀合物，并且 LysB29 比 PheB1反应性更高[2]。这种位点特异性偶联物仅需要三倍高的剂量，因此比之前的方法具有更高的活性。    

偶联物的毒性和免疫学评估很重要，在开发蛋白质-聚合物偶联物作为治疗药物时应尽早进行,此外偶联物的体内生物分布对其体内生物活性有重大影响。

总结与展望

在过去几年里，用于医学的蛋白质-PEG 偶联药物取得了重大进展。目前已有多种PEG 化蛋白质药物在临床上用于治疗一系列疾病。但是，仍有改进的空间，许多偶联物虽然增加了循环半衰期，但生物活性明显降低。研究表明，通过合理设计偶联位点，利用位点选择性偶联反应，可以充分保留蛋白质的活性。

此外，随着基因工程、高效偶联化学、以及合成用于共轭的末端功能聚合物的新方法的发展衍生了可降解的 PEG 替代品和新的仿生策略，以提高天然蛋白质的稳定性和活性。蛋白质-聚合物偶联将是一个令人兴奋的领域，需要具有不同学科专业知识的科学家共同努力，相信未来科学家们科可以改进大自然高度进化的机制，以促进人类健康。

参考文献:

[1] Lipsky PE. Pegloticase immunogenicity: the relationship between efficacy and antibody development in patients treated for refractory chronic gout. Arthritis Res Ther. 2014

[2] K. M. Mansfield and H. D. Maynard, ACS Macro Lett., 2018,7, 324–329.

[3] Emma M. Heather D. Maynard. Therapeutic Protein–Polymer Conjugates: Advancing Beyond PEGylation.Journal of the American Chemical Society 2014 136 (41), 14323-14332