截至2022年7月6日，全球已有超5.51亿人确诊新冠肺炎(COVID-19)，634.3万人死于新冠，对人类健康和全球公共卫生安全造成了巨大影响。世界卫生组织宣布COVID-19大流行为重大突发公共卫生事件。接种疫苗是控制流行病传播的最有效和最经济的干预措施，对拯救生命和保护人民的健康具有重要作用。在新冠肺炎疫苗的开发中多种技术被采用，其中信使RNA （mRNA）疫苗因其开发周期短、易于工业化、生产工艺简单、对新变体反应灵活、诱导免疫应答能力强等优点，具有广阔的应用前景。本文综述了COVID-19 mRNA疫苗的结构特征、抗原设计策略、给药系统、产业化潜力以及mRNA技术等方面的最新知识，还讨论了目前预防性mRNA疫苗开发所面临的挑战和未来的发展方向。

    SARS-CoV-2是冠状病毒科Beta属的一种包膜阳性单链RNA（ssRNA）病毒，于2019年底首次被发现，其全长基因组由29881个核苷酸（GenBank登录号为MN908947）组成，编码9860个氨基酸形成16个非结构蛋白（nsp）、9个附属蛋白和4个结构蛋白，其中四种结构蛋白包括刺突蛋白（S）、包膜蛋白（E）、膜蛋白（M）和核衣壳蛋白（N）。新冠肺炎疫情是一场前所未有的大流行，COVID-19一直在不断进化，以至于出现了多种新的变体，包括Alpha （B.1.1.7），Beta （B.1.351）， Gamma （P.1）和Delta （B.1.617.2）在内，每一种变异都引发了新一波COVID-19感染，导致全球确诊和死亡人数大幅飙升。2021年11月26日，一种名为Omicron （B.1.1.529）的新变体被世卫组织定义为第五种“关切变异株”，立即触发了全球卫生警报，对人类健康和全球公共卫生安全造成了严重影响。目前，还鲜有确定用于COVID-19预防或治疗的有效药物，疫苗接种是限制SARS-CoV-2传播的最经济和有效的干预措施。为了控制疫情的蔓延，世界各国政府动员了大量人力和物力资源投入到COVID-19疫苗相关的研发工作。目前已经同时测试了几种新冠肺炎疫苗开发方法，包括灭活病毒、减毒活疫苗、重组蛋白、腺病毒载体、流感病毒载体、mRNA和DNA疫苗。mRNA疫苗技术作为一项革命性的创新，在控制COVID-19大流行中发挥了独特的作用。

mRNA疫苗技术背后的基本机制是基于基因工程载体使核酸分子编码的抗原转入人类宿主的靶细胞，从而诱导宿主细胞产生抗体。当携带抗原的病原体再次入侵时，宿主的免疫系统可以迅速触发体液和细胞免疫反应，从而预防疾病（图1）。mRNA在体内被核糖体翻译成蛋白质，作为内源性抗原被蛋白酶体降解成抗原肽，通过主要组织相容性复合体（MHC） I类分子途径呈递给CD8+细胞毒性T细胞，激活细胞介导的免疫应答，这也构成了mRNA疫苗的关键优势。此外，翻译后的蛋白质可以分泌到细胞外环境从而进入循环系统，并被抗原提呈细胞（APCs）吸收，抗原肽作为外源性抗原通过MHC II类分子呈递给CD4+ T细胞，通过分泌细胞因子引起体液免疫反应，激活B细胞产生抗体，发挥体液免疫作用。同时，mRNA疫苗具有自佐剂效应，例如ssRNA可在核内体被toll样受体7 （TLR7）和toll样受体8（TLR8）识别并激活髓系分化标记物88 （MyD88）通路。一般来说，mRNA疫苗通过上述机制诱导产生抗体、细胞免疫反应和自佐剂效应。

图1 信使RNA （mRNA）疫苗诱导的细胞和体液免疫应答^[1]

mRNA疫苗根据其遗传特征可分为非复制mRNA、自复制mRNA （saRNA）和环状RNA （circRNA）三类（图2）。非复制的mRNA疫苗提供靶向抗原的独家遗传编码信息，经过优化或修饰的mRNA可以大大增强其生物活性。saRNA疫苗可以传递编码目标抗原和其他基因的遗传信息，例如病毒RNA聚合酶，使mRNA能够自我复制，基于saRNA技术，安全的反式扩增RNA （taRNA）疫苗得到了优化和开发。此外，circRNA由于其天然的高稳定性，最近也被用于COVID-19 mRNA疫苗开发。目前正在进行临床试验或已经上市的COVID-19 mRNA疫苗，大部分都是非复制的mRNA疫苗。

图2 不同类型mRNA疫苗的抗原表达^[1]

一个非复制的mRNA包含一个开放阅读框（ORF），它编码目标抗原的基因，其两侧有5' 非翻译区 （5' UTR）、3' UTR。5'UTR主要参与mRNA下游ORF序列的翻译，5'端含有7-甲基鸟苷帽状结构（5'-cap, m⁷G），阻止mRNA被外切酶降解；相反3' UTR的功能是维持mRNA的稳定性，3'端含有poly（A）尾状结构，这种结构增强了mRNA的稳定性，同时提高了mRNA翻译的准确性和效率（图3）。因此设计正确的5' UTR和3' UTR序列是mRNA疫苗成功的关键。

核苷酸修饰：宿主免疫系统很容易将未经修饰的mRNA或工程mRNA在体外转录（IVT）过程中形成的副产物识别为外源分子。单链 mRNA及其降解产物会被Toll 样受体 7 （TLR7）、 TLR3和 TLR8 识别，从而激活先天免疫系统的细胞，产生高水平的肿瘤坏死因子（TNF-α）和 干扰素α（IFN-α）。在IVT中添加修饰过的核苷可以显著降低宿主的炎症反应，而不影响蛋白质的表达。目前，可以用于mRNA修饰的修饰核苷有:伪尿苷（ψ）， N¹ -甲基伪尿苷（m¹ψ）， 5-甲氧基尿苷（mo⁵U）， 2-硫尿苷（s²U）， 5-甲基胞苷（m⁵C）和N6 -甲基腺苷（m⁶A） （图3）。

图3 mRNA疫苗的结构和核苷酸修饰^[1]

saRNA疫苗依赖于将编码目标抗原的基因插入RNA病毒（主要是甲病毒）的基因组，并利用其复制机制来放大递送的RNA，从而增加抗原表达。在结构方面，saRNA 在5 'UTR后包含一个长ORF编码四个甲病毒NSPs （nsP1、nsP2、nsP3 nsP4），发挥信使RNA限制酶的功能，一旦进入宿主细胞的细胞质，saRNA通过内源性核糖体机制进行翻译，从而使nsP前体翻译形成早期复制复合体。然后正链RNA被用作模板来合成负链RNA，负链RNA是复制的中间产物。随着nsP前体的分裂，后期复制复合体形成。然后，复制中间物负链RNA被用作模板合成全长正链基因组RNA。因此，saRNA的一个副本通过上述机制产生多个RNA转录本副本，从而启动细胞内抗原基因的自我扩增。

尽管如此，saRNA疫苗仍有一定的缺点，包括炎症反应过度激活，以及甲病毒复制子产生的病毒nsP可能干扰宿主细胞的正常信号转导。taRNA是一种由两个独立的RNA分子组成的自扩增RNA，这减少了重组病毒颗粒转移到宿主细胞的可能性。此外，taRNA技术在转移能力、多功能性和生产规模扩大方面具有潜在优势，因此具有广阔的应用前景。

CircRNA是一种高度稳定的单链RNA，具有共价闭合环结构。与线性RNA不同，circRNA在疫苗开发方面有几个优势，其环状结构可以防止外切酶降解，从而增加环状RNA的半衰期和稳定性。此外，与未修饰的线性mRNA相比，未修饰的circRNA已被证明可诱导TLR/RIG -I介导的先天免疫反应。circRNA具有不经核苷酸修饰而高度稳定的特性，有望成为疫苗和药物开发的新平台。

SARS-CoV-2表面的三聚体S蛋白在介导宿主细胞入侵中发挥关键作用，因此S蛋白被认为是疫苗设计的主要抗原。在病毒感染过程中，S蛋白被弗林蛋白酶（Furin）和跨膜丝氨酸蛋白酶2 （TMPRSS2）切割成S1和S2亚基。S1亚基由信号肽（SP）、RBD、N端结构域（NTD）、C端结构域1 （CTD1）和C端结构域2 （CTD2）组成，主要通过RBD与细胞血管紧张素转换酶2 （ACE2）受体相互作用；S2亚基包括融合肽（FP）、双七肽重复序列（HR）、中心螺旋区（CH）、连接结构域（CD）、跨膜结构域（TMD）和细胞质尾部（CT）， 负责介导病毒与宿主细胞膜的融合。RBD与宿主细胞膜上的ACE2受体结合后，S蛋白发生结构重排，形成融合后构象。研究发现，S蛋白融合前构象具有更好的免疫原性，因此可以被认为是一种理想的靶抗原。大多数中和性抗体是基于S蛋白融合前构象的表位塑造的，一旦S蛋白获得融合后构象，表位就被覆盖并减少中和性抗体的产生（图4）。

图4 COVID-19mRNA疫苗设计策略的基本原理^[1]

内含编码序列的ORF在体内被翻译成蛋白质，其是mRNA疫苗最关键的组成部分。为了提高mRNA疫苗的安全性、有效性和稳定性，研究人员通常对抗原编码序列进行密码子优化以提高翻译效率。密码子偏好在不同的生物体内差异很大，因此调节密码子使用频率和宿主tRNA可利用性之间的平衡可以显著提高翻译效率和目标抗原的体内表达。一些在线密码子优化工具和优化算法已经被开发出来用于mRNA疫苗设计。

目前设计COVID-19 S蛋白常用的策略有两种：2P突变和S1/S2切割位点（图4）。2P突变策略基于中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）、非典型性肺炎病毒（SARS-CoV）和人类冠状病毒HKU1 （HCoV-HKU1）融合前构象中S蛋白的研究结果。2P突变方法适用于SARS-CoV-2等β-冠状病毒，采用这种策略，S2亚基中心螺旋位置顶部的两个氨基酸被脯氨酸（K986P和V987P）取代，有效地提高了S蛋白融合前构象的稳定性。S1/S2裂解位点策略采用直接替换野生型序列Q677TNSPRRARYSV687为 Q677TILRYSV683或氨基酸RRAR突变为GGSG的方法，最终阻止S蛋白在宿主细胞中分裂，从而保持其结构稳定性并诱导更强的免疫应答。一些研究机构已经开发出独特的优化S蛋白的策略，如删除S2亚基上的TMD、CT、FP，并突变S2切割位点（K814A, R815N），以提高融合前S蛋白构象的稳定性。在某些情况下，可以在ORF区域的前段插入额外的序列，以增加抗原蛋白的表达。由于S蛋白是三聚体，研究表明，在S蛋白或RBD蛋白编码区3端引入T4噬菌体纤维蛋白的三聚体基序，可以模仿S蛋白的固有结构，增强抗原的免疫原性。以往的研究发现，选择不同的信号肽时，靶抗原蛋白表达水平存在显著差异，S蛋白信号肽MFVFLVLLPLVSSQCV已被包括BioNTech在内的多家开发商用于COVID-19 mRNA疫苗，RiboBio利用免疫球蛋白重链可变区（IGVH）信号肽序列（MDWIWRILFLVGAATGAHS）在COVID-19 mRNA疫苗中增加靶蛋白的表达。简而言之，由于mRNA疫苗涉及序列编辑，因此可以对S蛋白的结构、稳定性和表达进行修饰改善其空间构象，从而提高疫苗诱导的免疫反应。

由于mRNA分子量大（10⁴ - 10⁶ Da），带负电荷，且易被核酸酶降解，因此其在细胞膜磷脂双分子层中传递比较困难。近年来，各种用于mRNA封装的传递载体被开发出来，包括脂质纳米颗粒（LNPs）、多聚体和聚合纳米颗粒、脂多聚体（LPPs）和阳离子多肽。脂质及其衍生物因其低免疫原性、生物相容性和高包封率而被认为是一种新的mRNA疫苗传递系统。脂质体是1965年首次发现的LNPs的早期版本，是最早从概念到临床应用成功的纳米药物传递平台，下一代LNPs包括固体LNPs、纳米脂质载体和阳离子脂质-核酸复合物，具有更复杂的内部结构、稳定性和靶向能力。除疫苗外，这些物质还可作为抗癌和核酸治疗的新型药物传递平台。

随着mRNA传递系统和核酸修饰技术的出现，mRNA技术在预防新冠感染方面的研究进展迅速。

在大流行之初，BioNTech与Pfizer合作开发了5种新冠病毒mRNA候选疫苗，到目前为止均已进入临床试验。5种候选疫苗基于核苷修饰mRNA (BNT162b2、BNT162b1、BNT162b3)、非修饰mRNA (BNT162a1)和自增mRNA (BNT162c2)。其中，核苷修饰后的mRNA设计了3种不同的抗原类型: BNT162b2编码全长刺突糖蛋白，在S2亚基中有两个脯氨酸突变，旨在保持蛋白融合前的构象；BNT162b1编码三聚体刺突蛋白RBD的一种分泌型。临床试验数据表明，上述两种候选mRNA疫苗诱导的中和抗体水平相当。然而，鉴于BNT162b2的反应原性较轻，疫苗开发商最终决定继续进行BNT162b2的II/III期国际临床试验。随后，BNT162b2 mRNA疫苗于2020年12月31日被加入世界卫生组织紧急使用清单，并分别于2021年5月10日和5月28日被美国政府和欧盟批准用于12至15岁青少年的接种。BNT162b2疫苗对Beta和Alpha变种的有效性分别为75.0%和89.5%，对Delta变种的有效性仅为51.9%，但是三剂BNT162b2疫苗接种可能对Delta和Omicron介导的COVID-19感染有保护作用。

Moderna公司开发的mRNA-1273编码SARS-CoV-2的全长预融合刺突蛋白，是美国政府于2020年12月18日接受EUA的第二支mRNA疫苗。临床试验结果表明，mRNA-1273在青少年和成人中普遍具有良好的耐受性和安全性。数据显示，mRNA-1273对Alpha和Beta变种的有效性分别为100%和96.4%，而对Delta变种的有效性略低（73.1%）。三剂mRNA-1273对Delta感染具有高而持久的保护作用（95.2%），但对Omicron的保护作用较低（62.5%）。尽管疫苗对SARS-CoV-2的有效性随着时间的推移而下降，但BNT162b2和mRNA-1273仍能有效预防Delta和其他变体的感染，其中mRNA-1273的表现略优于BNT162b。

加拿大Providence Therapeutics生产的COVID-19疫苗PTX-COVID19-B已进入II期临床试验。研究表明，PTX-COVID19-B可诱导高滴度的针对野生型SARS-CoV-2和多种变体（包括Alpha、Beta和Delta）的中和抗体。此外，Abogen公司在中国研发的ARCoV mRNA疫苗已进入III期临床试验。据报道，ARCoV耐受性良好，可诱导高滴度的中和抗体。

mRNA疫苗的生产不像传统的疫苗生产技术那样需要培养细胞或病毒，而是依赖于体外合成技术。因此，生产周期更短，易于规模化，从而为疫苗生产的快速工业化提供了可能性。从mRNA的IVT到mRNA-LNP复合物的制备，mRNA疫苗的整个生产周期可能持续大约10天。考虑到认证和审批所需的时间，该产品可以在40天内上市。作为一种技术平台，mRNA疫苗技术广泛兼容任何mRNA序列，几乎所有基于蛋白质的疫苗都可以使用该技术生产。通过确定目标抗原并优化其编码序列，可在体外用RNA聚合酶进行转录。合成的mRNA通过不同的过程纯化，然后使用微流体与脂质相混合，封装成mRNA-脂质纳米颗粒（mRNA- LNP）复合物。随后，通过超滤稀释浓缩完成LNPs的自组装。最后经无菌过滤、充填、盖膜，获得mRNA疫苗（图5）。

图5 mRNA疫苗的生产过程^[1]

在COVID-19出现之前，mRNA技术主要用于开发新的癌症治疗药物，并显示出良好的效果。新冠肺炎大流行促进了mRNA疫苗技术的发展，成为预防和治疗多种传染病的手段，新一代疫苗逐步进入公众视野，受到越来越多的关注。目前，COVID-19 mRNA疫苗在限制当前大流行蔓延方面发挥着关键作用。与传统疫苗不同的是，mRNA疫苗可以调整抗原设计，甚至可以将几个变体的序列结合起来，以应对病毒基因组的新突变。在未来，mRNA技术平台将使预防和控制传染病以及治疗其他疾病成为可能。然而，mRNA疫苗超低温条件下储存的要求可能对其运输和储存构成挑战。因此，mRNA疫苗的稳定性有待进一步探索和优化。此外，关于mRNA递送系统的研究正在进行，以探索未来用于mRNA传递的新型高分子材料。目前mRNA疫苗所具备的安全性和保护作用是令人满意的，但它们的长期保护作用还需要进一步的临床研究才能确定。

[1] Fang E, Liu X, Li M, et al. Advances in COVID-19 mRNA vaccine development.  Signal Transduction and Targeted Therapy. 2022, 7(1): 1-31.