应佰傲谷邀请，斯微生物联合创始人兼CTO-沈海法博士在“2022 疫苗创新高峰论坛”上做了《mRNA个性化肿瘤疫苗的研发》的报告。本文系根据报告内容整理，并经报告人确认。

01 为什么要研发个性化肿瘤疫苗？
此前，世界卫生组织国际癌症研究机构（IARC）发布了 2020 年全球最新癌症负担数据。数据显示，2020 年全球新发癌症病例 1929 万例、全球癌症死亡病例 996 万例；其中，中国新发癌症病例 457 万例、中国癌症死亡病例 300 万例。从该数据可以发现，全世界肿瘤的发病率很高。究其原因，主要是现在治疗肿瘤的药物，无论是大分子或小分子，其治疗效果都不太理想。
左：2020 年各国癌症新发病例数；右：2020 年各国癌症死亡病例数，而这些药物治疗效果不理想的原因，与药物到达肿瘤组织时遇到的物理和生物屏障有关。 2015年《Nature Biotechnology》上发表的一篇文章《principles of nanoparticle design for overcoming biological barriers to drug delivery》即对药物治疗效果不理想的原因做了相关阐释：包括血液流变学/血管流量限制、压力梯度、细胞内化、内体和溶酶体逃逸等皆会影响药物最终的治疗效果。

根据近10年批准的抗体药物也可以看到，部分药物在免疫治疗上虽然已经取得了一定的成效，但还是差强人意。如此前刊发的两篇文章《TGFβ attenuates tumour response to PD-L1 blockade by contributing to exclusion of T cells》和《Safety, Activity, and Immune Correlates of Anti–PD-1 Antibody in Cancer》中提到： 有60%的病人在接受PD-1/L1药物治疗后有效果，但还有40%的病人对没有产生相关的免疫反应； 有些病人尽管产生了一定的免疫反应，但在后续的治疗中却出现了耐药性。其主要原因可能是，激发的T细胞仅仅是在外部癌旁组织而并没有进入肿瘤组织，那么这类药物的作用就不大。
不过，基于过去十几年里在基础研究中取得的一些进展，以上问题有了其他的解决方案。 据2013年《Nature》上发表的一篇文章《Signatures of mutational processes in human cancer》，科研人员通过对肿瘤组织的基因测序，可以检测到大批的基因突变。实际上，利用这些基因突变信息，可以设计个性化肿瘤疫苗。相比传统药物，肿瘤疫苗的优势在于可以激发产生肿瘤新生抗原反应性T细胞，这些T细胞在进入到肿瘤组织里并富集后，可以有效地杀伤肿瘤细胞。另一方面，肿瘤疫苗如果和PD-1/L1等抗体药物联用，也许能产生更好的治疗效果。癌细胞因为基因突变，能够产生只在肿瘤中表达的新抗原（neoantigens），这些新抗原可以被人体的T细胞识别，并且对表达它们的癌细胞进行攻击。因为这些新抗原不在健康组织中表达，因此它们是治疗性癌症疫苗的理想靶点之一。

细胞在成长过程中，基因组不断受到内源性和外源性DNA损伤的威胁，使得细胞基因组不断发生变化，并最终发生一些突变的积累。每一个突变过程都会留下一个不同的基因组标记，即突变特征（mutational signatures）
那么，如何设计肿瘤疫苗呢？
首先，进行患者健康组织（例如外周血单核细胞（PBMC））和肿瘤活检样本的下一代测序，比较来自肿瘤和正常DNA的测序数据以识别肿瘤特异性突变。其次，通过计算方法，如主要组织相容性复合体（MHC）结合预测、突变转录物表达的定量、突变的克隆性和其他特征，根据其引发T细胞反应的可能性，将突变作为抗原候选。最后，使用所选择的疫苗平台（如mRNA或长肽），在良好生产规范（GMP）条件下按需生产个体化和多特异性肿瘤新生抗原疫苗。
02 研发mRNA个性化肿瘤疫苗存在的现实问题
当然，制备个性化肿瘤疫苗的理想是好的，但在现实中仍有一些问题需要克服：
mRNA修饰问题
mRNA疫苗的作用机理是先表达抗原蛋白再激活相应免疫反应，但如果mRNA在没有翻译成抗原蛋白前就诱导强烈的免疫反应，可能会抑制抗原的表达从而降低疫苗的有效性，甚至有可能会出现过敏反应伤害人体。好在Katalin Karikó等人发现，把核苷酸进行甲基化了以后能降低其免疫原性。

递送问题
此外，因为mRNA的分子量较大（1-100万道尔顿）而且带负电荷，很难穿透也带负电荷的细胞膜上的脂质双分子层。同时，mRNA在体内很容易被免疫细胞吞噬或酶切等导致降解，所以制备个性化肿瘤疫苗还面临着递送系统的选择问题。
在mRNA递送系统的选择上，脂质纳米粒（Lipid Nanoparticle，LNP）是目前主流的载体递送方式，如Pfizer & BioNTech和Moderna的mRNA新冠疫苗都采用的LNP递送技术。 其递送机理为：将mRNA结合在LNP内部（可以提高mRNA在体内的稳定性），并逃离溶酶体的降解。LNP被细胞吸收后，核内体的低pH环境将与LNP融合，并释放mRNA进入胞质胶体。 
总体上，LNP的递送效果还是不错的（至少在mRNA新冠疫苗上），无论是Pfizer & BioNTech还是Moderna，mRNA新冠疫苗在2021年的销售额都达到了几百亿美元。
03 基于LPP平台的mRNA个性化肿瘤疫苗
不过，如果是应用于mRNA个性化肿瘤疫苗，那么LNP递送系统不一定非常合适。因为肿瘤的内环境具有免疫抑制性，怎么样克服免疫抑制性的肿瘤内环境是决定肿瘤治疗成功的一个关键性因素。 好在自然界给我们提供了一个答案：动物亦或人，在进化过程中都产生了对外界的一种免疫反应：当微生物进入机体，免疫细胞能精准识别不同形状、大小和组分的细菌和病毒。以图9中列举的两种mRNA的病毒颗粒（流感的病毒颗粒和新冠病毒的病毒颗粒）为例，当他们进入人体以后，就会触发机体的内部免疫，免疫细胞进而对其识别并吞噬，或使病毒的影响降到最低。
 
而我们可以利用人体的这种防御机制去设计一种类病毒结构，将mRNA递送到人体。对此，斯微生物就研发了这么一类病毒平台——LPP (lipopolyplex) 纳米递送平台。
LPP递送平台的技术优势
该平台可以通过带负电的mRNA和带正电的聚合物混合形成一种致密的核，再包裹脂质双层形成类似于病毒颗粒样的核-壳结构。基于这种以聚合物包载mRNA为内核、磷脂包裹为外壳的双层结构，能使机体的免疫细胞对他们产生非常强的反应。 在此基础上，我们还对这个系统进行了一定的优化。比如调整mRNA和脂质体的比例，使之定向地将mRNA颗粒送到肺部、肝脏或者脾脏。从图10中可以看到，如果我们给小鼠皮下接种，这些LPP-mRNA就能够到达淋巴结；如果给小鼠肌肉接种，会发现大部分的LPP-mRNA停留在接种部位，同时有一些随着淋巴液去淋巴结。
 
此外，我们还与百度合作，开发云计算辅助的抗原分析，以优化 mRNA 序列，使mRNA能够高效地表达蛋白。具体而言，通过测序，确定患者肿瘤细胞独有突变，也就是肿瘤新生抗原，这些新生抗原可以帮助免疫系统区分肿瘤细胞和正常细胞。再利用算法，预测出能够引起强免疫应答的多条新生抗原，然后将其信息装载到一条 mRNA 分子上。找到表达水平最高的mRNA后，再放到LPP系统里面，组成mRNA疫苗。
云计算辅助的抗原分析，预测，序列优化 当然，LPP-mRNA的效果如何还是要看实际的应用案例。
应用案例 案例一：蛋白替代治疗
在人体内有种很重要的基因——PAH基因。该基因可以表达一种将苯丙氨酸转化成酪氨酸的酶，如果肝脏缺乏了这种酶的话，会产生一些意想不到的毒副作用，包括神经毒性等。而部分产生PAH基因突变的人群，将不再产生这种酶。所以我们需要想办法让mRNA来表达这种苯丙氨酸转化酶。 因此，我们合成了这么一种mRNA，并放到LPP系统里面。同时，也放到LNP系统里以作为对照组。然后分别注射到小鼠体内，过了几个小时以后，再观察肝脏里面的表达情况。观察发现，用LPP递送系统来递送的mRNA在肝脏里面表达量相对较高，无论是第一种剂型还是第二种剂型都表达很高，从这点上说明LPP的效果还是很好的。

案例二：肿瘤疫苗 如果是用于治疗性的肿瘤疫苗呢？
在这方面，我们也做了相关的实验：首先，把mRNA包在LPP的递送平台里，然后把这个肿瘤疫苗接种到带有肿瘤的荷瘤小鼠，并观察疫苗进入体内后去到什么地方，被什么细胞吞噬，是不是真正被免疫细胞吞噬。基于这一构想，给小鼠注射肿瘤疫苗后，我们把其淋巴结取下来，分析淋巴结里的各种各样树突状细胞（DC细胞）的组成，以及哪一些DC细胞吞噬了LPP-mRNA疫苗分子。 经过分析，可以明显的看到，接种了LPP-mRNA肿瘤疫苗后，淋巴结里面总的 DC细胞是升高的，而且在CD8的DC细胞里面可以看到较多的LPP-mRNA。

同时，我们还把这些小鼠的T细胞拿出来（无论是淋巴结里面的T细胞还是脾脏里面的T细胞都），然后测一下 T细胞的活力，发现给小鼠接种LPP-mRNA疫苗以后，这些淋巴结里面的T细胞或者脾脏里面的T细胞能够分泌出IFNγ，也就是说，用肿瘤疫苗治疗了以后，这些组织里面的T细胞都被活化了，而对照组就没有这个现象。

另外，我们还把小鼠的肿瘤组织（一组来自对照组，另外一组来自疫苗组）取出来进行肿瘤内环境变化的分析。我们发现，对照组里有非常多免疫抑制性的MDSCs；而在疫苗组里，这部分细胞的比例逐渐下降，也就是说接种了疫苗后，肿瘤内环境有所改善。另外，肿瘤里面本来没有太多的CD8 T细胞，经过疫苗治疗后，CD8 T细胞开始在肿瘤里面富集，其中还有大部分为抗原特异性的CD8 T细胞。由此，可以预测，肿瘤的生长被极大地抑制了。
临床数据
最后是临床实验数据的分享。 我们现在已经在澳大利亚开展了临床一期的实验，同时也在国内发起了用个性化肿瘤疫苗治疗病人的临床实验。在实验中，研究人员首先对病人的组织进行全基因测序，然后结合其他组学数据进行高效分析，再针对每个病人制备相应的个性化肿瘤疫苗。

其治疗案例包括腺癌伴淋巴结及肝转移的病人和卵巣癌病人：
①腺癌伴淋巴结及肝转移病人
从图中可以看到，开始时这个病人的肿瘤很大，而进行两个cycle后，肿瘤开始变小，四个cycle后变得更小了。与此同时，我们还对病人的血液进行了分析，发现4个cycle后，表达IFNγ的T细胞也增加了很多。

②卵巢癌病人
这个病人的生存期本来预测不到三个月，但现在病人已经被治疗了200多天，还生活得很好。此外，在对病人经过不同治疗cycle后的血样进行分析后发现，即使到了第8个cycle，病人体内还存在着很多的肿瘤新生抗原的特异性T细胞，说明病人对治疗有积极的反应。

小编荐语
应用mRNA疫苗技术研发新型治疗性和预防性肿瘤疫苗，为肿瘤治疗带来了新的机会，是继肿瘤化疗、放疗、细胞免疫治疗之后的新型治疗方式。当然，肿瘤疫苗的研发和生产涉及很多因素，作为一种新型的生物制品或者药物，肿瘤疫苗距离大规模临床应用还有一段比较曲折和艰难的道路，尤其在国内技术相比国外仍有差距的情况下，中国mRNA肿瘤疫苗的发展更显艰难。而斯微生物作为国内最早开展mRNA药物研发生产的企业，其对mRNA个性化肿瘤疫苗的探索具有重要意义。 
 

沈海法博士

沈海法博士是斯微（上海）生物科技股份有限公司的联合创始人，并担任该公司的CTO。沈海法博士具有丰富的学术界和工业界的经验。他于1997年在美国德克萨斯大学休斯敦安德森肿瘤中心研究生院获得博士学位，并于2001年在美国国立肿瘤研究院完成博士后训练，随后进入生物制药行业，投身于抗肿瘤新药的研发，并在工业界工作了8年。沈博士于2009年回到学术界，专注于新药设计和新型药物递送技术的研究，并担任美国康奈尔大学医学院教授和康奈尔大学医学院附属休斯敦卫理公会医院肿瘤中心转化医学首任主任。沈海法博士和他的小组发表了100多篇研究论文，其中多篇刊登在Nature 和Nature Biotechnology等杂志，并获得了10多项专利技术的申请和授权。

参考资料：
1.principles of nanoparticle design for overcoming biological barriers to drug delivery 1.Safety, Activity, and Immune Correlates of Anti–PD-1 Antibody in Cancer
2.TGFβ attenuates tumour response to PD-L1 blockade by contributing to exclusion of T cells
3.Signatures of mutational processes in human cancer
4.Identification of neoantigens for individualized therapeutic cancer vaccines
5.mRNA vaccines — a new era in vaccinology
6.Overcoming cellular barriers for RNA therapeutics
7.Lipid Nanoparticle Systems for Enabling Gene Therapies
8.《mRNA肿瘤疫苗研发的挑战和前景展望》药学进展、2022.08.01
9. 2020全球癌症报告

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