作者：王恒1 ，毕静2，张媛1，潘苗苗1，郭庆龙2，肖根辉1，崔雨萌1，胡松1，陈子健1，袁鹰1，Takushi Kaneko3，张国良2，陈烁1

作者单位：1 北京全球健康药物研发中心；2深圳市第三人民医院及深圳国家感染性疾病临床医学研究中心；3 美国结核联盟机构 TB Alliance

通信作者：

毕静，Email: bijinghappy@126.com；

陈烁，Email：shuo.chen@ghddi.org

研究背景

       ATP为细胞的生物合成提供能量，同时也能通过如磷酸化修饰调控蛋白的功能。许多成功的抗癌药物尤其是蛋白激酶抑制剂对许多细菌中ATP依赖的酶也可能具有抑制作用。为了寻找新的抗结核化学药物先导化合物，我们针对结核分支杆菌的必需基因谷氨酰胺合成酶（GlnA1），筛选了再利用化合物库，发现靶向IGF1R/IR的临床药物Linsitinib（LIN）能够显著的抑制GlnA1。LIN具有直接杀死结核杆菌的活性。生化实验和分子模型揭示，LIN以和ATP竞争而产生抑制作用。LIN也能提高THP1巨噬细胞的自噬，具体表现为p-mTOR和p62的减少，脂质结合LC3B-II和自噬小体的增加。LIN单独或与贝达喹啉联用，能够通过调控自噬来减少细胞内野生型和异烟肼抗性结核杆菌的生长。总之笔者初步发现了蛋白激酶IGF1R/IR的抑制剂有治疗结核病的潜在功效，同时此研究也进一步说明针对ATP依赖酶的抗结核新药筛选可能引入新的结核病治疗方法。

研究方法

      通过优化生化实验方案，建立了高灵敏度筛选结核分枝杆菌GlnA1抑制剂的方法，并进行了高通量筛选。同时，利用生化实验分析了化合物的抑制模式。使用CRISPRi技术建立了GlnA1条件性敲低的H37Ra菌株，测定了LIN和多种已知靶点为GlnA1的化合物的最低致死剂量变化。通过分子对接，多位点突变，研究了GlnA1不同突变体蛋白的多种生化参数（Kcat和Km）和对LIN结合解离值（Kd），提示了LIN对GlnA1可能的作用位点。利用免疫印迹，克隆形成和共聚焦成像，分析了LIN对巨噬细胞里中自噬相关通路的影响，以及和贝达喹啉共同处理结核杆菌感染的THP-1细胞的抑菌、杀菌情况。

研究结果

一、GlnA1抑制剂筛选和测定

      利用孔雀石绿检测GlnA1酶活反应产生的磷酸根的方法，筛选了MMV(抗疟疾药物开发组织)的病原体化合物库。鉴定出了比对照工具化合物（11a）抑制活性更强的小分子LIN，IC50的值达到了70nM。同时比对几种已知的GlnA1的抑制剂，LIN也是体外抑制能力最好的。

图1 使用MMV病原体盒库筛查Mtb GlnA1的结果和hit确认

二、抑制机理分析

      首先通过酶反应动力学测定LIN以与ATP竞争的方式与GlnA1结合抑制其活性，测定出的Ki为24nM（图2A）。利用分子对接，预测了LIN结合在GlnA1腺苷位点上与相应氨基酸的结合模式（图2B），LIN结合GlA1的电势模型（图2C），以及LIN与ADP结合GlnA1的重叠图（图2D）。氨基酸定点突变后对多指标的测定提示S280对LIN的结合具有重要作用（图2E）。

      图2 抑制LIN的机制

三、抑菌靶向分析

    为了验证LIN的抑菌活性是否直接作用于GlnA1，我们利用CRISPRi技术构建了可调控的glnA1转录敲低的H37Ra菌株。通过加入不同剂量的ATc （四环素类诱导剂）增下调glnA1表达，发现LIN最低抑菌浓度降低了3-4倍（图3A），GlnA1的已知小分子抑制剂MSO更是有10倍的变化（图3B），对照分子利福平（靶向RNA聚合酶）则没有浓度变化。综合分析，揭示在结核分枝杆菌细胞里LIN可以通过直接作用于GlnA1从而达到抑制结核杆菌生长的目的。

图3 可诱导CRISPRi超敏Mtb对glnA1抑制剂的glnA1转录沉默

四、LIN能够促进巨噬细胞THP-1的自噬流

      我们使用人巨噬细胞系THP-1发现与对照相比，LIN处理后LC3B-I转化的LC3B-II水平显著积累（图4A），这指示LIN在THP-1巨噬细胞中诱导自噬，而Cleaved Caspase-3水平没有差异，指示没有诱导凋亡。此外，在未感染（UI）或Mtb感染的THP-1细胞中发现了LIN处理后MTOR磷酸化水平下降，同时自噬通量增加（图4B）。为了进一步证实LIN能够诱导巨噬细胞的自噬激活，我们使用含有MRFP-GFP-LC3报告基因的THP-1细胞，利用共聚焦显微镜在自噬体和自溶液中的LC3富集。结果显示LIN处理后，在感染的MTB和未感染的THP1巨噬细胞中西自噬体和自噬溶酶体水平均升高（图4CE）。综合分析，LIN促进巨噬细胞自噬通量。

图4  LIN治疗增强THP-1巨噬细胞的自噬通量

五、LIN通过调控自噬抑制结核杆菌在THP-1细胞中的生存

      许多研究表明，自噬的发生有助于消除细胞内细菌，我们发现LIN处理以剂量依赖性的方式显着降低了MTB H37RV在巨噬细胞内的存活率（图5A）。值得注意的是，LIN以同样的方式可以抑制临床耐异烟肼和利福平的MTB菌株的胞内存活率（图5B），此外，当LIN与MTB治疗药物贝达喹啉（Beda）结合使用时对MTB具有联合治疗效果（图5C）。初步结果表明，LIN在巨噬细胞水平具有抑制MTB存活的作用，后续可以通过动物模型进一步探索LIN的HDT效果。

图5 LIN介导的自噬抑制THP-1巨噬细胞内的细胞内Mtb存活

研究结论

      通过靶向特定基因的生化筛选，我们发现人激酶抑制剂LIN是Mtb必需酶GlnA1的抑制剂。LIN通过与ATP竞争的方式抑制GlnA1的功能，与它抑制人激酶IGF1R/IR的作用方式相同。LIN不仅能够通过直接作用于结核杆菌来抑制细菌生长，我们进一步分析还发现它能激活巨噬细胞的自噬，从而对细胞内的细菌起到清除的作用。综上所述，我们新发现人激酶抑制剂Linsitinib具有直接靶向结核细菌的比需酶基因，同时激活人细胞自噬来清除胞内结核分枝杆菌。

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编辑：于  菲

审校：范永德

发布时间：2022-10-20

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