文章来源：中国防痨杂志，2022，44(11)：1205-1212.

doi: 10.19982/j.issn.1000-6621.20220276.

作者：唐明慧，李浩

作者单位：中国农业大学动物医学院，北京 100193

基金资助：“十四五”国家重点研发计划(2021YFD1800405)；国家自然科学基金面上项目(32070937)；2115中国农业大学人才培育发展支持计划(00109029)

摘 要

结核病是由结核分枝杆菌复合群引发的人畜共患病，甘露糖帽修饰的脂阿拉伯甘露聚糖(mannose-capped-lipoarabinomannan，ManLAM)是结核分枝杆菌细胞壁上重要的成分，具有免疫调节作用，能够被固有细胞和适应性细胞所识别。作为结核病诊断的生物标记物，存在于体液的ManLAM具有较好的特异性，有区分结核分枝杆菌潜伏感染和活动性结核病的潜力，对于不能获取痰液的结核病患者也具有一定的检测价值。笔者系统介绍ManLAM的结构、生物合成及ManLAM的相关抗体等，并对其在结核病诊断中的研究进展进行总结，以期为结核病诊断技术的研发提供参考。

结核病是由结核分枝杆菌复合群(Mycobacterium tuberculosiscomplex，MTBC)引起的人畜共患病，是全球重要的公共卫生问题。我国作为结核病高负担国家，全国5岁以上人群结核分枝杆菌潜伏感染率为18.08%。因此，提高结核病的诊断和治疗技术显得尤为重要。痰涂片显微镜检查可以通过离心及添加化学试剂如漂白剂和NaOH等来提高检测敏感度。但其对于不能产生痰液的HIV阳性结核病患者和儿童结核病患者存在局限。结核菌素皮肤试验和γ-干扰素释放试验都无法完全区分活动性结核病和结核分枝杆菌潜伏感染(latent tuberculosis infection，LTBI)。GeneXpert MTB/RIF或Xpert Ultra成本过高，对于经济落后地区无疑是一种负担。 结核病理想的诊断技术是能够区分结核病患者、LTBI者及治愈者。与上述检测技术相比，结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)细胞壁释放或者细胞表面的脂阿拉伯甘露聚糖(lipoarabinomannan，LAM)作为生物标记物在结核病的诊断中独具优势，具有区分LTBI和活动性结核病的潜在价值，对于不能产生痰液的HIV阳性结核病患者及儿童结核病患者的检测也具有诊断价值，成本相对较低，且痰液中的甘露糖帽修饰的脂阿拉伯甘露聚糖(mannose-capped-lipoarabinomannan，ManLAM)可作为结核病治疗前后细菌负荷量的生物标志物,评价治疗效果。本文中，笔者将系统介绍LAM的结构、LAM的识别抗体及其表位特征，以及LAM的检测应用等，旨在为LAM作为结核病免疫学诊断标志物的开发和应用提供参考。

一、LAM的结构   (一)分枝杆菌属细胞壁、荚膜及质膜相关糖脂 LAM是所有分枝杆菌属的细胞壁上的一类重要抗原，具有高度免疫调节活性，能够参与宿主与病原体相互作用。根据不同分枝杆菌的LAM所修饰的帽不同，MTB、牛分枝杆菌、麻风分枝杆菌等慢生长致病性分枝杆菌主要是ManLAM，耻垢分枝杆菌等快生长的非致病性分枝杆菌是磷脂酰肌醇帽修饰的脂阿拉伯甘露聚糖(phosphatidyl-myo-inositol capped LAM，PILAM)。MTB的ManLAM由α-(1→2)-连接的吡喃甘露糖苷(mannopyranose，Manp)单糖、二糖和三糖单元广泛封端，ManLAM的甘露糖帽介导抑制促炎反应。而PILAM的磷脂酰肌醇帽能诱导人类巨噬细胞分泌促炎细胞因子。 MTB的细胞壁核心主要由3个结构组成：特征性长链分枝菌酸、高度分支的阿拉伯半乳聚糖多糖 (arabinogalactan，AG)和交联的肽聚糖。MTB的细胞壁上含甘露糖的糖脂有ManLAM、脂甘露聚糖(lipomannan，LM)及甘露糖苷(mannosides，PIM)，其亲水部分位于质膜空间，并通过其脂质部分镶嵌于质膜，外膜也存在这些糖脂，发挥调节蛋白和黏附素的作用。MTB最外层荚膜多糖主要由葡聚糖(70%~80%)、阿拉伯甘露聚糖(arabinomannan，AM；10%~20%)和甘露聚糖组成。具体见图1。
 (二)LAM的结构及其生物合成   ManLAM是国外研究最为广泛的结核病诊断标志物，是一种高度支化的脂聚糖[相对分子质量为(17.3±5.0)×1000]，由甘露糖基磷脂酰肌醇锚、甘露糖核心骨架、阿拉伯聚糖结构区域和甘露糖帽四部分组成，约占细菌总干重的15%。细胞膜成分磷脂酰肌醇在一系列酶的作用下甘露糖基化、酰基化形成PIM，异质性的PIM常见有PIM2和PIM6。Ac1PIM4和Ac2PIM4是形成糖基化终产物LAM和LM的常见中间产物。LAM是在LM中加入55~70个阿拉伯糖苷产生的。ManLAM比LM多阿拉伯聚糖及帽子结构，它们对于分枝杆菌细胞壁的完整性及发挥致病作用十分重要。PIM和LM不具备单抗亲和力或者亲和力低。AM是一种中性且异质的荚膜多糖，AM被脂化时形成LAM，是LAM的免疫原性组成部分(图2)。MTB糖脂PIM、LM、LAM存在共同成分，存在相互竞争或协同适应性细胞和固有细胞受体，在MTB感染期间产生免疫反应。

图2   脂阿拉伯甘露聚糖的结构与生物合成及相关抗体结合表位

注 Manp：吡喃甘露糖苷；D-Araf:D-阿拉伯糖苷；MTX-Man2帽：5-甲硫基-D-木呋喃糖-二甘露糖帽；MPI：甘露糖基磷脂酰肌醇；PI：磷脂酰肌醇；LM：脂甘露聚糖；ManLAM：甘露糖帽修饰的脂阿拉伯甘露聚糖；Ac1PIM2：一酰化磷酸肌醇二甘露糖苷；Ac1PIM4：一酰化磷酸肌醇四甘露糖苷；Man：甘露糖；Ac：酰基化；Ara4：四阿拉伯糖苷；Ara6：六阿拉伯糖苷；甘露糖基转移酶：PimA、PimB’、PimC、PimE、MptA和 MptB；阿拉伯呋喃糖基转移酶：EmbC、AftD、ArafT；甘露糖帽合成酶：CapA和 MptC

ManLAM具有一定的异质性。体内及体外培养、不同结核病流行地区的MTB临床分离株ManLAM的结构也存在差异。阿拉伯聚糖结构中有一条线性Ara4和一条支链Ara6，是抗体主要识别的表位区域。5-甲硫基-D-木呋喃糖(5-methylthio-d-xylofuranose，MTX)-甘露糖帽是MTB的ManLAM特有结构，该表位对于MTB具有特异性，而麻风分枝杆菌和耻垢分枝杆菌缺少。 (三)ManLAM来源、分布及应用   LAM可以在体外培养的分枝杆菌中提取，酰基化的LAM具有极性，且溶于水。研究发现，经过热灭活的分枝杆菌其表面的LAM会减少。据推测，LAM是分枝杆菌有机体活性代谢或者降解释放的产物。巨噬细胞吞噬菌体主动分泌LAM，后者以凋亡小体的形式传递到抗原提呈细胞，从而促进T淋巴细胞活化，还能抑制细胞因子的产生、吞噬溶酶体成熟、巨噬细胞的凋亡和自噬，促进白细胞介素-10(interleukin-10，IL-10)表达从而延缓机体对MTB的清除。LAM在血液中以单体形式不稳定，便在血清中与高密度脂蛋白等载体分子结合，经过血液循环，流经肾脏。LAM具有抗原性，导致不能直接通过肾小球，以免疫复合物的形式通过肾脏过滤进入尿液，因此，尿液中的LAM浓度高于血清。很多研究都证实了结核病患者的尿液、唾液、血液中存在LAM，结核病病牛的牛奶也可以检测出LAM。LAM化学性质相对稳定，比较耐热，耐蛋白酶，无论新鲜尿液还是冻存尿液都不影响其检测。这也增加了LAM在临床适用的靶向性。 ManLAM能被人类CD1b限制性T细胞识别并激活。利用这个特点，相关糖蛋白疫苗不断诞生。AM抗体可以用于合并HIV感染的结核病患者的诊断，但是由于接种卡介苗也会产生相应抗体，且检测不稳定，世界卫生组织不建议抗ManLAM抗体用于血清学诊断。接种卡介苗的牛产生的抗LAM的抗体主要为IgG2和IgG1，且能通过胎盘屏障进入初乳。针对分枝杆菌细胞壁成分的抗体具有免疫保护作用，抗ManLAM或AM抗体在MTB感染期间和卡介苗接种后均被诱导，LTBI者或者接种卡介苗的健康人体内的抗AM的IgG具有保护作用，有调理吞噬作用的活性，而活动性结核病患者体内的抗体往往不具有保护作用，其相关ManLAM抗体亲和力低且IgG/IgM比值低。 二、ManLAM相关单克隆抗体   针对ManLAM的单克隆抗体有很多，一般来说人源性抗体不适用于诊断人类结核病，因为这些抗体在用于人体标本检测时会产生较深的背景染色。相比之下，其他类型的抗体用于人体标本的检测更占优势。此外，抗体的亚型也影响着LAM的检测。研究发现，体外纯化的LAM更倾向于与IgG2结合。但检测样本抗体的亚型往往是IgG1和IgG3，导致这类现象的原因可能是感染MTB后不同时期阶段分泌的抗体有所差异，也有可能是机体内外的LAM表位有所差异。 电化学发光免疫检测评估了各种针对LAM表位的单克隆抗体，结果显示，虽然许多抗体能够与纯化的LAM发生特异性结合，但是应用于临床标本时，检出率偏低。这更加证实了高度异质性的LAM的结构及不同抗体针对的表位存在明显差异。针对ManLAM的抗体有很多，具体见表1。
(一)鼠源性抗体  
CS-35是将粗糖免疫小鼠后通过麻风分枝杆菌的LAM提取的乙醇沉淀物来筛选的针对麻风分枝杆菌的鼠源性抗体。CS-35是广谱单克隆抗体，对LAM、AG及AM都识别，对分支Ara6表位具有优先亲和力，还与线性Ara4和Ara5结合。CS-35的反应性对是否存在甘露糖帽完全不敏感。CS-40是针对MTB的Erdman株的ManLAM产生的鼠源性抗体，识别LAM和AM，与未加帽的Ara4表位结合较弱，但优先识别以单个Manp残基和MTX 衍生物为帽的Ara4和Ara6结构。CS-40识别ManLAM的同时也识别PILAM，PILAM虽然没有任何甘露糖帽修饰的结构，导致交叉反应性可能是CS-40与未修饰的Ara4聚糖的反应性介导的。FIND家族抗体只识别Ara6，不识别Ara4，对Manp残基不敏感。鼠源性抗体面临的问题是抗体产量低，并且溶解性低导致无法纯化。
(二)人源性抗体  
A194是从1例接受抗生素治疗的活动性肺结核患者记忆B细胞得到的抗体。A194主要针对ManLAM的阿拉伯聚糖的Ara4和Ara6表位，以及对甘露糖帽结构的一个子集。与其他抗体不同的是，A194的表位基本上存在于所有ManLAM分子。除了CS-40，A194不与其他单克隆抗体竞争表位结合。使用MTB的AM作为探针筛选来自未感染或者暴露人群的高抗AM IgG，可产生针对AM 聚糖表位且无交叉反应性的单克隆抗体，例如T1AM04和T1AM09。My2F12是从人类非免疫Fab-Ab噬菌体展示文库中分离出来组成的人鼠嵌合抗体。该单克隆抗体具有接近亲本的亲和力，与PILAM无交叉反应。
(三)兔源性抗体  
MoAb1通过噬菌体展示技术从用卡介苗免疫兔产生的scFv文库分离得到重组单克隆抗体，主要识别ManLAM的MTX帽。虽然MTX是MTB ManLAM的特有部位，但是MTX封端残基以低丰度存在，通常每个ManLAM分子只有1个MTX残基，所以，这有可能导致检测的敏感度降低。BJRbL01和BJRbL03是用MTB标准株H37Rv细胞壁免疫兔子，再通过噬菌体展示技术筛选出针对ManLAM的抗体，能区分慢生长的MTBC和快速生长的非结核分枝杆菌。S4-20和FIND28均能检测HIV阴性结核病患者的ManLAM，且能很好排除环境中潜在的非结核分枝杆菌的干扰。

三、ManLAM检测方法的研发和应用   尿液LAM检测可以作为一个重要的诊断工具，抗原LAM具有反映分枝杆菌负荷量的潜在优势，且尿液与痰液相比，前者在实验室处理比较安全，见表2。研究表明，尿液LAM检测有可能提高合并HIV感染的结核病患者的诊断率。世界卫生组织2016年建议的侧流尿脂阿拉伯甘露聚糖测定法(lateral flow lipoarabinomannan assay，LF-LAM)测定LAM适用于CD4+T淋巴细胞≤100 个/μl的HIV阳性结核病患者，该检测方法敏感度较低。全球大部分结核病患者是HIV阴性，找到适用于此类人群检测的方法十分重要。相比之下，日本的FujiLAM(Fujifilm SILVAMP TB LAM)使用了针对主要MTB特异性LAM表位的高亲和力单克隆抗体，并增加了银扩增步骤。该检测在成人中检测结核病的敏感度为75%，检测儿童结核病的敏感度为64%。该试剂盒适用于HIV阳性结核病患者的临床诊断，对于身体状况较差的儿童结核病患者也具有诊断价值，可以弥补GeneXpert MTB/RIF检测遗漏的结核病患者。
CD4+T淋巴细胞≤100个/μl的HIV阳性结核病患者尿液LAM的浓度大于10 ng/ml，而CD4+T淋巴细胞计数高的HIV阳性结核病患者尿液LAM的浓度约为10~1000pg/ml。A194及S4-20单克隆抗体能检测绝大多数HIV阴性结核病患者。关于HIV阴性结核病患者尿液的LAM检出率低的原因，大概有3种推测：一是标本中的蛋白与LAM络合在空间上阻碍了LAM抗原与抗体的特异性结合，循环中的抗LAM抗体也影响血清中LAM的检测。二是当MTB感染肾脏或者肾功能不全时，LAM抗原才可以直接从感染组织进入尿液中。三是LAM具有高度异质性，大部分抗体针对的是从培养基中提取的LAM，但临床样本与培养基中LAM所呈现的表位不同，这便导致了检测敏感度的降低。如果检测技术的敏感度足够高，测定HIV阴性结核病患者的血清和尿液中的LAM是完全可行的。电化学发光测量尿液中的LAM比血清的准确性更高。除了与LAM结合的免疫复合物，基质组分如氨基酸、多肽、脂质、代谢终产物等也会掩盖或者改变LAM表位。有研究者即使用蛋白酶或者酸来破坏样本中大分子物质，从而提高诊断敏感度和准确性。去酰基化的LAM和保留Ara6丰度也能提高检测敏感度。 HIV阴性结核病患者细菌负荷量相对HIV阳性结核病患者低，导致前者尿液LAM浓度偏低。结核病的发展阶段、合并症、器官菌载量、感染情况等可能会导致患者机体的LAM分布发生变化。例如，抗体糖表位类别对糖尿病与结核病共病患者尿液中的LAM具有不同的敏感度，也就使得不同抗体对于糖尿病与结核病共病患者检测敏感度有所不同。 Crawford等将金纳米颗粒(AuNP)标记抗体做夹心法ELISA，利用表面增强拉曼散射(surface-enhanced Raman scattering，SERS)检测血清中的ManLAM，放大了检测信号。蓝藻凝集素与ManLAM的甘露糖有较高亲和性，蓝藻凝集素功能化磁珠的ELISA检测尿液中ManLAM效果较好。Paris等设计水凝胶纳米笼，应用高亲和力铜络合物染料捕获ManLAM，排除其他物质的干扰，大大提高了检测敏感度。Wood等将等离子体光栅与抗LAM捕获抗体结合，一同与患者尿液样本和生物素化检测抗体孵育，该检测结果满足世界卫生组织所建议的检测敏感度(>65%)和特异度(>98%)要求，为针对LAM抗体的现场快速检测提供技术支持。Broger等利用电化学发光免疫测试测量HIV阳性和阴性结核病患者尿液和血清中LAM，敏感度分别可达到93%和55%。Divagar等利用等离子体光纤吸光度生物传感器检测ManLAM，在U型弯曲光纤探针上进行等离子体夹心免疫测定，在缓冲液和合成尿液中ManLAM的检测限分别低至 1fg/ml和10fg/ml。 核酸适体与抗体类似，具有易修饰、高亲和力、高特异性等优点。Tang等通过指数富集方法从北京基因型MTB菌株中制备一种针对MTB的ManLAM特异的单链 DNA 适体(T9)“抗体”，T9对血清或痰液中的ManLAM具有较高的亲和力，用于免疫组织化学检测可使检测敏感度明显提高。

四、结语

ManLAM具有免疫调节的功能，作为结核病的诊断标记物独具优势。但是国内目前使用相关诊断标记的方法较少。在检测活动性结核病患者ManLAM时，为了提高检测敏感度，可以从三方面入手：一是解决从大容量样本中获取低浓度的ManLAM或者克服基质反应的问题。因HIV阴性结核病患者细菌负荷量较低，导致体内ManLAM浓度低，需要将夹心ELISA或者免疫层析法与其他技术联用来放大检测信号，从而提高检测敏感度和特异度。样本中存在免疫复合物、大分子蛋白、反应抑制剂等，采用适当的样本预处理技术可以进一步提高检出率。二是获得高质量的单克隆抗体。由于ManLAM具有高度异质性，获取具有高特异性、高亲和力，且针对单一表位的抗体是有难度的。体外提取的ManLAM和内源性ManLAM抗体表位存在一定差异，而市面上大多抗体都是针对体外提取的ManLAM，采用B淋巴细胞筛选技术从患者体内获取的抗体来检测ManLAM效果可能会更佳。另外，寻找抗体的代替品例如核酸适配体来检测ManLAM也是不错的选择。第三是增加MTB新型标记物。诊断试剂盒的开发除了利用ManLAM外，还可以利用MTB分泌的早期分泌抗原靶6和培养滤液蛋白10辅助检测，从而提高诊断的准确性。

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编辑：王   然   

审校：郭   萌

发布日期：2022-11-29

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