作者：李元, 姚晓伟, 唐亮, 董伟杰, 兰汀隆, 范俊, 刘丰胜, 秦世炳

第一作者及单位：李元，首都医科大学附属北京胸科医院

通信作者及单位：秦世炳，首都医科大学附属北京胸科医院

Diagnostic efficiency of metagenomic next-generation sequencing for suspected spinal tuberculosis in China: A multicenter prospective study

Li Y, Yao XW, Tang L, Dong WJ, Lan TL, Fan J, Liu FS, Qin SB.

Frontiers in Microbiology, 2022, 13:1018938.

doi: 10.3389/fmicb.2022.1018938.

研究背景

结核分枝杆菌是导致死亡患者数最多的单一感染性致病菌，据世界卫生组织报告2020年全球新发结核病约580万例，大约150万例死于结核病。骨关节结核是常见的肺外结核类型之一，脊柱结核约占骨结核患者的50%。近年来，疑似脊柱结核患者中非结核感染的比例逐渐增加。虽然非结核性脊柱感染与脊柱结核具有相似的临床症状和影像学表现，但其治疗方法却不同。因此，需要对其进行鉴别诊断。由于病原菌种类繁多，传统的检测方法受到了巨大的挑战。目前缺乏一种能够同时检测结核病和非结核病病原体的快速有效的诊断方法。在这里，我们使用宏基因组下一代测序 (metagenomic next-generation sequencing，mNGS) 来检测疑似脊柱结核患者的病原体。

研究方法

1.患者入组：从2021年1—12月，从3家结核病专科医院的骨科前瞻性入组疑似脊柱结核患者。纳入研究的患者有疑似脊柱结核的临床表现。这些表现包括：（1）持续背痛至少3周；（2）低热 (<38 ℃)；（3）红细胞沉降率升高（男性>15 mm/1h，女性>20 mm/1h）；（4）脊髓磁共振成像异常。

2.mNGS检测：使用TIANamp Micro DNA Kit（天根生物技术，北京，中国），按照制造商的说明从每个预处理样品的300μl中提取DNA。将纯化后的DNA用超声分割成200～300 bp的片段，末端修复，多重条形码适配器连接，PCR扩增，完成DNA文库的构建。在用标度PCR估计DNA文库的量浓度后，用DNA量子比特测定法 (Thermo Fisher) 测定DNA浓度。同时，使用Agilent 2100系统 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, usa) 对DNA质量进行电泳评估。将多达20个合格的DNA文库汇总，然后使用MGISEQ-2000平台 (MGI Tech Co.， Shenzhen, China) 对汇总的文库进行DNA测序分析。

3.生物信息学分析：使用mNGS鉴定感染性病原体的报告标准包括：（1）细菌或真菌的相对丰度>30%；（2）单一病毒、细菌或真菌物种至少3个特异reads；（3）结核分枝杆菌至少一个特异read。如果检测到一种以上的病原体，相对丰度最大、特异reads数量最多的被认为与该患者的骨关节感染有关。

研究结果

1.患者分组：采用前瞻性研究方法，连续纳入114例疑似脊柱结核患者，最终有100例通过手术或CT引导穿刺获得标本，被纳入本研究。根据综合诊断标准（composite reference standard，CRS）, 38例患者被诊断为脊柱结核，53例患者被诊断为非结核性脊柱感染，9例患者被诊断为非感染性脊柱疾病。

2. 病原体组成：本研究采用mNGS、MGIT 960培养、细菌培养、Xpert等方法对82例脊柱感染患者进行病原菌检测。结果显示，37例为结核病，45例感染了其他细菌。45种非结核细菌包括：布鲁氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、真菌、咽峡炎链球菌、肺炎克雷伯菌，分别占28.9% (13/45)、22.2% (10/45)、8.9% (4/45)、6.7% (3/45)、6.7% (3/45)和4.4% (2/45)。此外，45种非结核性细菌中有10种只检测到1次。3种真菌分别为白色念珠菌、光滑念珠菌和假丝酵母菌。图1显示了82例脊髓感染患者中检测到的病原体组成。

图1  82例脊柱感染患者病原菌组成

3. mNGS与常规检测方法在脊柱感染患者中的表现：在所有脊柱感染患者中，mNGS、培养 (包括MGIT 960和细菌培养) 和病理检查的敏感度分别为89.0% (81/91)、28.1% (25/89)和42.9% (30/70)。mNGS检测的敏感度高于培养和病理检查。此外，mNGS检测的敏感度与培养和病理检查的差异有统计学意义（P值均< 0.001）。在所有脊柱感染患者中，mNGS、培养(包括MGIT 960和细菌培养)和病理检查的特异度分别为8/9、9/9和9/9。mNGS检测的特异度与培养和病理检查的特异度的差异均无统计学意义（P值均 = 1.000）。表1显示了mNGS和常规检测方法在脊柱感染患者中的表现。

4. mNGS与常规检测方法在脊柱结核患者中的表现：在脊柱结核患者中，mNGS、Xpert、MGIT 960培养、病理检查和T-SPOT.TB的敏感度分别为94.7% (36/38)、 94.6% (35/37)、45.9% (17/37)、 67.9% (19/28)和89.2% (33/37)。mNGS法与Xpert和T-SPOT.TB的敏感度差异无统计学意义（P = 1.000，P = 0.430）。与MGIT 960培养和病理检查相比，mNGS检测的敏感度更高，差异有统计学意义（P < 0.001, P = 0.006）。在脊柱结核患者中，mNGS、Xpert、MGIT 960培养和病理检查的特异度均为100.0%。在脊柱结核患者中，T-SPOT.TB的特异度 (78.3%)低于mNGS测定法(100.0%)，两种测定法特异度的差异有统计学意义(P < 0.001)。表2显示了mNGS和常规检测方法在脊柱结核患者中的表现。

5. mNGS与常规检测方法在非结核性脊柱感染患者中的表现：mNGS检测、细菌培养和病理检查对非结核性脊柱感染患者的敏感度分别为84.9% (45/53)、15.4% (8/52)和26.2% (11/42)。与细菌培养和病理检查相比，mNGS检测的敏感度较高，差异有统计学意义 (P值均<0.001)。mNGS、细菌培养和病理检查在非结核性脊柱感染患者中的特异度分别为97.9% (46/47)、100.0% (43/43)和100.0% (37/37)。mNGS检测的特异度与细菌培养和病理检查的特异度差异无统计学意义（P值均=1.000）。表3显示了非结核性脊柱感染患者mNGS和常规检测方法的表现。

研究结论

mNGS对疑似脊柱结核患者是一种快速有效的诊断工具。与常规检测方法相比，mNGS可以同时检测结核分枝杆菌和非结核细菌感染，从而避免漏诊和误诊。mNGS还具有较高的敏感度、特异度和较短的检测时间。mNGS也有一些缺点，还需要进一步的研究。

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供稿：李    元

编辑：孟    莉

审校：范永德

发布日期：2023-01-20

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