作者首先合成了三个衍生物，P1、P5和P10，每个骨架平均数量分别为3、20和28条共价连接的DNA链。单个聚合物批次可用于组装具有不同特性的材料。在细胞培养研究中，含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸 （RGD）基序的合成肽与骨架相连，以促进细胞粘附和机械信号传导。接枝了RGD的衍生物PRGD5和PRGD10与不含肽的衍生物具有相似的分子量。令研究者惊讶的是，最初尝试将低浓度聚合物与简单的夹板链交联未能产生稳定的凝胶。由于凝胶刚度与有效交联的数量成正比，研究者假设无效的分子内键比形成网络的分子间交联占主导地位。分子内键合不是DNA凝胶所特有的，而是聚合物凝胶中的普遍现象，通常会将交联效率降低到20%或更低。

图1 DyNAtrix的基本概念和交联剂设计

统计模拟说明了CCL复杂性和每种聚合物的锚链数量如何影响交联效率。为了抑制80%的分子内交联，P1、P5和P10预计分别需要4、40和60对夹板。研究者首先用含1、4、16、64或256对夹板（CCL-1至CCL-256）的CCL文库补充了P5。弹性模量（G′）在很宽的频率和应变范围内大大超过了损耗模量（G“），证实了双夹板覆铜板与UHMW聚合物结合可产生稳定的凝胶。随着CCL复杂性的逐渐增加，交联效率从1%（CCL-76）提高到64%（CCL-64），CCL-64的文库大小没有进一步增加，这与预测非常吻合。

图2. DyNAtrix通过覆铜板交联的理论预测和流变学验证

下一个目标是使DyNAtrix与标准细胞封装工艺兼容。研究者最初试图通过快速混合两种预退火的前驱体溶液来封装电池来避免对细胞产生损害。然而，快速结合动力学导致在混合完成之前快速形成交联，从而形成刚度不足的不均匀基质。作为解决方案，研究者设计了热活化交联剂（HAC），通过升级CCL设计与封闭链封闭链可作为保护组，防止低温下过早的重叠结构域结合。因此，两种聚合物前体溶液的混合物在37°C下被困在亚稳态液态中，使得细胞和培养基的混合可以进行完成。封闭链被设计为在37°C下自发地从重叠结构域中解离，从而激活交联剂。与该设计一致，加热至4°C导致快速形成均匀的凝胶具有优越的刚度，随后用于所有细胞培养实验。

图3. DyNAtrix 的热可逆性、自愈性、生物打印和可调应力松弛

图4. HAC 可在细胞兼容条件下实现 DyNAtrix 的受控凝胶化

DNase I是一种常见于血清补充培养基中的核酸酶，基于DNA的凝胶容易受到DNase I的意外消化。作者目标是保护DyNAtrix，同时在需要时保留受控酶修饰的选择。研究者首先在添加胎牛血清的培养基存在下测试了DyNAtrix的稳定性，发现48小时内确实发生了实质性降解。然后，测试了肌动蛋白的作用。使用荧光标记的DNA模拟靶标，发现肌动蛋白可用于调节DNase I的消化速率。浓度为50 μg/ml足以抑制凝胶在48小时内降解，80 μg/ml近乎完全抑制DNase I，在细胞培养实验中将DyNAtrix保存至少2周。通过添加柠檬酸盐也实现了类似的有效保护。然而，由于柠檬酸盐对钙离子的螯合被怀疑会影响细胞发育，作者选择肌动蛋白作为默认保护策略。

图5. DyNAtrix在细胞培养中表现出可调的降解稳定性、高生物相容性和DNase I介导的活细胞释放

为了验证先进细胞培养和类器官研究的适用性，DyNAtrix中嵌入了另外三种细胞类型：（1）人诱导多能干细胞（hiPSCs），为细胞水平的体外疾病建模提供了患者特异性平台，（2）Madin-Darby犬肾（MDCK）细胞，用于发育上皮组织的模型系统，（3）发育成滋养层类器官的人滋养层干细胞（hTSC），用于胎盘发育和妊娠相关疾病的体外研究。作者评估了细胞的活力、增殖和自组织，并测试了粘附位点（[+RGD]与[-RGD]）对其发育和形态发生的影响。

图6. DyNAtrix与多种3D细胞和类器官培养物兼容