辅助化疗推荐用于部分高选择性的IB期患者和所有II期和IIIA期完全性切除术后的NSCLC患者，患者的5年生存率约为5%左右。目前，临床上尚无有效的预后和/或预测标志物可以筛选能够从辅助化疗中获益的人群。LACE协作组在汇总了所有辅助治疗的研究后（包括IALT，LGB9633，JBR.10和ANITA研究），确立了辅助化疗的地位。对这些研究中收集的FFPE标本进行检测，有望开发出预后和预测指标，从而指导临床决策。

LACE-Bio-II（LB2）研究的目的旨在全面评估完全性切除术后的NSCLC患者，拷贝数变化和体细胞突变的预测效能。这一研究不仅可以为生物标志物开发提高重要依据，此外采用靶向二代测序对LB2研究中患者标本的全面检测也有助于深入了解NSCLC患者的基因组学特征。本研究报道了LB2研究中采用包含1538个基因的靶向panel（基于TCGA泛癌症分析）测序908例患者标本的结果。ANITA研究中收集的标本未纳入本次分析，因为标本已经耗尽。对测序的结果，研究者分析了单个基因变异，不同DNA修复通路，TP53突变类型，非同义肿瘤突变负荷在预测辅助化疗疗效和预后中的价值。此外，既往的研究也对LB2研究标本进行了TILs和PD-L1表达检测（IHC法），也整合进入本次分析。

研究采用覆盖1538个基因的靶向测序panel对908个FFPE切除肺肿瘤标本进行测序。目前对于同义突变的功能尚未明确，因此本次分析仅纳入非同义突变，包括错义、无义、剪接点和框移突变。主要研究终点为DFS，定义为随机至第一次复发或死亡的时间；次要研究终点包括OS和肺癌特异性生存（LCSS）。

本次分析纳入3个LB2研究中的1608例患者，其中1008例患者有FFPE肿瘤标本可以进行评估。在评估可可以进行测序的组织数量和质量后，最终共908例患者的标本进行了靶向测序。其中27%的标本来自女性患者，患者诊断时的中位年龄为60岁，大多数患者为II期（75%），I期和III/IV期患者分别为114例和114例，见下表1.

表1.患者临床特征

在过滤掉低VAF的C>T转换后，中位非同义TMB为5.7/Mb，错义突变是最常见的突变类型（38%），其他非同义突变发生率家底，无义突变和剪接点突变发生率分别为3.5%和4%。研究者同时分析了者TCGA肺腺癌和肺鳞癌队列中显著突变的基因，并对比了其中TCGA和LB2样本中的突变频率，结果显示，在肺腺癌和肺鳞癌中，这些基因的突变频率相当，见图1A和1B。

图1A. 瀑布图显示在TCGA队列中具有显著统计学意义的突变基因，在LB2队列肺腺癌患者中的突变频率

图1B. 瀑布图显示在TCGA队列中具有显著统计学意义的突变基因，在LB2队列肺鳞癌患者中的突变频率

在LB2样本中，肺腺癌和肺鳞癌患者突变率差异较大的基因包括KRAS（19% vs 2%），TP53（44% vs 69%）和STK11（21% vs 2%）。在70%（n=265）的肺腺癌样本中检测的受体酪氨酸激酶/RAS信号通路突变，见下图2。在肺腺癌中，KRAS是最常见的突变基因，发生率为19%（n=72），与预期一致，在肺鳞癌标本中，KRAS，HRAS，NRAS和EGFR突变率<3%。在LB2队列中，仅1例鳞癌患者检测的EGFR L858R突变。

图2A. 约70%的肺腺癌样本在RTK/RAF通路上至少有切割基因突变

图2B. 所有非腺癌标本中的突变基因和突变类型

在908例LB2标本，1538个基因中，1515个基因检测到非同义突变。研究中计算所有测序样本的TMB以评估TMB对预后的影响。鉴于LB2样本中，仅测序了1538个基因的非同义突变来计算TMB，这一方法计算的TMB十分可以替代全外显子组计算的TMB？研究者对TCGA数据库中的测序数据进行分析，评估与TCGA数据库匹配的1214个LB2基因，并根据这些基因突变计算TMB，再与全外显子组测序数据计算的TMB进行对比，结果显示两者具有显著相关性，R2=0.96；P<0.001。

非同义TMB与DFS，OS和LCSS显著相关，见下表2。对所有组织学类型的患者，根据TMB分为3组，低TMB组（<=4m/Mb）、中TMB组（4-8m/Mb）、高TMB组（>8m/Mb）。高非同义TMB组患者有较好的预后，而低TMB组患者预后较差，DFS、OS和LCSS的P值分别为0.007，0.016和0.001。对于DFS HR，低TMB组对比中等TMB组为1.2（95% CI：0.97-1.5）；对比高TMB为0.88（95% CI：0.70-1.1）。非同义TMB还能显著预测肺腺癌患者的LCSS（P=0.04）以及肺腺癌、肺鳞癌患者的OS（P分别为0.034和0.042），见下表2。探索性分析提示，采用灵活线性模型非同义TMB可能可与显著预测患者的LCSS（P=0.023，见表2和图3），但不能预测DFS（P=0.06）和OS（P=0.33）。这一模型提示辅助化疗对LCSS对获益主要见于低TMB患者，且随着TMB的增高，辅助化疗的获益降低。这可能是由于高TMB组患者的数目减少，当根据三分位数对TMB进行重新分组时，差异无统计学意义，见下表2. 在LB2样本中，为观察到肿瘤MATH评分和疗效的相关性。假设非同义突变可以作为新抗原负荷和抗肿瘤免疫反应的标志，则应该分析活检标本中TILs的密度与非同义TMB和MATH评分的相关性。然而，为观察到TILs和非同义TMB以及MATH评分有显著相关性。此外，研究者还采用E1L3N抗体检测了805个标本PD-L1表达，并根据肿瘤细胞和间质细胞PD-L1表达水平高低分别分为<1%、<25%和<50% 3组和<1%、<10%和<25% 3组。尽管研究发现间质PD-L1表达与TIL浸润相关，但高非同义TMB或MATH评分与PD-L1表达不相关。

 共571例样本检测到TP53非同义突变，TP53突变无预测和预后价值，见下表2所示。此外，研究者同时评估了，DNA修复相关基因突变、抗原提呈和处理以及肿瘤进展相关通路的突变状态，如WNT通路，结果显示，均未观察到上述相关通路的基因突变具有预测或预后价值。

表2.LB2队列中，TP53突变状态，DNA修复通路的突变，MATH评分，突变负荷的预测和预后价值

图3. 非同义TMB对OS（A）、DFS（B）和LCSS（C）的预后作用；D.采用灵活线性模型，在接受辅助化疗的患者中评估突变负荷对LCSS获益的影响；E-G.不同TMB水平对LCSS的预测价值。

本研究结果提示，高的非同义TMB可以作为切除术后NSCLC患者较强的预后和预测指标，可以潜在发现那些不太可能从辅助化疗中获益的患者。后续需要进行进一步的研究以确认这一相关性，以及探索其中潜在的机制。