背景  

在社会管理中，应急管理的一条关键原则是建立专门的应急指挥中心——即整合信息、制定计划、分配责任和部署资源的地方。我们的免疫系统采用了同样的策略来应对微生物的威胁——建立结构化的淋巴组织。在感染早期阶段，传统树突状细胞 (cDCs) 会将侵入者的信息传递到附近区域的淋巴结 (与脾脏、扁桃体和派氏斑等都属于次级淋巴器官)。在淋巴结内，大量的效应 T 细胞在调节性 T 细胞的监督下，在 cDCs 表面寻找它们的同源抗原，从而优化免疫反应。然而，广泛及慢性的威胁还需要更靠近作战部位的临时指挥中心。“三级淋巴结构” 和 “淋巴滤泡” 就是这样的新生的前沿淋巴样组织，而产生这些结构的过程被称为淋巴新生（lymphoid neogenesis）。淋巴新生过程可以发生在多种感染器官内、以及自身免疫和炎症性疾病过程中，也可出现在器官移植和恶性肿瘤中。

三级淋巴结构 (TLS, Tertiary lymphoid structures) 是指在非淋巴组织中发现的类淋巴结构。TLS 多见于多种处于发炎状态的组织中，可驱动免疫细胞活化，其形成与慢性炎性疾病、自身免疫病和癌症等多种慢性疾病有关。在肿瘤环境中，TLS 可促进免疫细胞浸入实体瘤，因而 TLS 的发展与未经治疗的患者的生存率显著相关。同样地，在接受免疫检查点抑制剂治疗的患者中，TLS 的发展通常与改善的治疗反应有关。这提示了 TLS 是产生抗肿瘤免疫位点的猜想。因此，将其作为提高患者抗肿瘤免疫力和有利于治疗反应的一种手段引起了人们广泛的兴趣。最近，Schumacher 和 Thommen 教授联手回顾了 TLS 的生物学概念的发展，并概述了 TLS 研究的最新进展，讨论了如何检测和定义 TLS，其在癌症中的形成机制，以及如何发掘 TLS 提示免疫治疗效果的潜力。  

全文速览  

三级淋巴结构 (TLS) 是指个体出生后体内形成的位于非淋巴组织的组织性免疫细胞聚集结构。正常生理条件下，体内并不存在 TLS。TLS 一般在慢性炎症背景下出现，例如自身免疫性疾病、慢性感染和癌症等。除了少数例外情况，肿瘤中的 TLS 的存在与免疫治疗后更好的预后和临床结局相关。但是，尽管 TLS 被认为很重要，但癌症中 TLS 形成的驱动因素以及这些结构对肿瘤内免疫反应的具体贡献仍不完全清楚。因此，有必要综合整理关于 TLS 在癌症中的现有知识用于加深对这一新兴领域的认识。本文的重点包括：1）TLS 形成的驱动因素，2）TLSs 在抗肿瘤免疫反应中的功能和贡献，以及 3）TLS 作为人类癌症治疗干预靶点的潜力。

▲ 多重免疫荧光染色：免疫细胞在两个 TLS 中的分布：B细胞 (绿色: CD20)，T 细胞(黄色: CD3)，巨噬细胞 (品红: CD68)， 辅助性 T 细胞 (橙色为: CD4)， 杀伤性 T 细胞 (红色: CD8) 和 DNA (蓝色: DAPI)。图片由 M. Zelazowski/ P. Castro/Baylor 提供

TLS 在解剖学上类似于次级淋巴器官 (SLO, Secondary Lymphoid Organs)，最初被认为主要是由类似的刺激因素诱导形成。然而，目前的证据表明，为两种不同淋巴结构的形成提供刺激信号的细胞类型和信号系统并不完全相同。例如，有证据表明肿瘤特异性 T 和 B 细胞免疫可能会提供 TLS 形成和维持所需的一些分子，而这些驱动因素的异质性也可能导致了不同 TLS 的状态差异。据推测，TLS 在发炎的组织部位表现出 SLO 功能，现有证据表明 TLS 对肿瘤特异性免疫反应强度的贡献具有合理性。然而，我们目前仍不清楚这种贡献是否主要涉及 SLO 中产生的 T 细胞反应性的增强或新的 T/B 细胞反应性的发展。

▲ 二级和三级淋巴结构的基本特征 （Nature Review Immunology）

此外，肿瘤部位 TLS 的存在，或许为产生不同性质的免疫反应提供了可能性。具体而言，由于 TLS 并非封闭结构，TLS 中驻留的免疫细胞可能直接暴露于来自发炎微环境的信号分子，而这一特性可能会塑造肿瘤内免疫反应的独特性质。最后，最近的研究表明，TLS 在对免疫检查点阻断的临床反应中的扮演着重要作用，这可能使这些结构成为有吸引力的治疗靶点。然而，此类策略的制定应考虑到身体其他部位的淋巴组织异位形成的可能后果。

TLS 在癌症中的预后和预测价值，推动了人们发掘 TLS 的抗肿瘤免疫潜力的兴趣。尽管许多癌症类型中都已鉴定出了 TLS，但用于定义和表征 TLS 的标志物在不同研究中通常并不统一，这使得比较预测值和评估癌症类型之间的 TLS 异质性的工作异常复杂。因此，开发测量 TLS 数量和组成的标准化方法，可能有助于进一步揭示 TLS 在不同疾病环境中的预测和预后评估价值。与此相关的是，基于细胞组成、位置、成熟度和功能等方面的评估而对 TLS 进行更全面的表征，可能会推动识别出一系列不同的 TLS 状态。与癌症中 T 细胞状态的定义类似，这将大大提高我们对特定 T 细胞亚群在肿瘤特异性免疫过程中作用的理解，而 TLS 状态在分子水平的定义，则有助于提高 TLS 作为预后和预测标志物的价值。最后，更好地理解 TLS 的功能和 TLS 对自身免疫毒性的潜在贡献，对于最大限度地发挥 TLS 作为新的潜在治疗靶点也具有非同寻常的价值。

为什么要研究 TLS?  

多年来的研究已经证明，肿瘤病变部位的某些免疫浸润的存在与许多癌症实体的更好预后有关。近年来，通过输注体外扩增的肿瘤浸润 T 淋巴细胞 (TIL) 或通过阻断 T 细胞免疫检查点分子来增加肿瘤特异性 T 细胞反应性，已经取得了非常显著的治疗效果。此外，活跃的免疫浸润与肿瘤对免疫检查点阻断 (ICB) 的反应性的良好相关性，也天然地将免疫治疗和 TLS 联系到一起。尽管上述数据支持对癌症病变中的免疫浸润进行常规化的评估，但越来越多的证据表明，我们不仅可以分析癌症部位免疫细胞的存在，还可以收集免疫细胞的定位和相互作用等额外信息。

一个相对简单的优化方案，是根据 T 细胞在肿瘤边界或肿瘤实质中的位置对 T 细胞进行细分。正如预期，肿瘤实质中 T 细胞的浸润与较好的临床结果相关，但这是否反映了在那些具有持续的肿瘤特异性 T 细胞反应的肿瘤对 T 细胞的吸引力增加，或者 T 细胞的主动排斥浸润其他的肿瘤中，仍然是一个亟待解决的重要问题。  

除了肿瘤内免疫细胞的位置外，肿瘤内免疫浸润细胞的聚集情况也非常重要。例如，对乳腺癌中免疫浸润的分析表明，具有类似比例的免疫细胞浸润的肿瘤，可能会表现出截然不同的空间分布，称为混合和区室化组织。更重要的是，由免疫细胞簇和癌细胞簇的物理分离定义的分隔组织与患者生存率的增加高度有关，而患者生存率却与 TIL 密度无关。尽管在这项研究中，预后预测潜力并未正式与三级淋巴结构 (TLS) 的存在发生关联，但最近在许多人类恶性肿瘤中的其他研究，已经报告了癌症组织中的 TLS 与改善预后和对 ICB 的反应相关。总的来说，这些观察结果表明，尽管肿瘤中的免疫浸润很重要，但以 TLS 为组织形式的肿瘤浸润免疫细胞可能更为重要。未来几年我们应该进一步解决的主要问题，包括导致癌症中 TLS 形成的分子过程、癌症相关 TLS 的类型以及它们的存在对产生或维持肿瘤特异性免疫的客观结果。

癌症中免疫浸润的组成和组织

TLS，有时也称为三级淋巴器官或异位淋巴结构，是个体出生后在非淋巴组织中出现的由免疫细胞而成的有组织的聚集结构。TLS 在生理条件下并不存在，而是在慢性炎症环境中形成的。这些慢性病例条件包括，自身免疫性疾病、同种异体移植物排斥、慢性炎症和癌症等。TLS 在多种癌症类型中均已见报道，例如非小细胞肺癌 (NSCLC)、结直肠癌 (CRC)、卵巢癌和黑色素瘤。TLS 的发生可能在不同癌症类型之间有所不同，但目前可用的数据集使用了大量不同的标记物用于识别 TLS，因此不同癌症类型的数据尚无法进行直接比较。  

▲ 三级淋巴结构的组分及分布示意图（Cellular & Molecular Immunology）

下面我们简单介绍一下 TLS 的结构特征： CD20+ B 细胞的内部区域被 CD3+ T 细胞包围，形成类似于次级淋巴器官 (SLO) 的淋巴滤泡。尽管不同 TLS 的具体组成可能有所差异，但在 T 细胞区室中 CD4+ T 滤泡辅助 (TFH) 细胞通常都是主要的细胞亚群，而 CD8+ 细胞毒性 T 细胞、CD4+ T 辅助 1 (Th1) 细胞和调节性 T 细胞（Tregs）也可以存在。虽然 B 和 T 细胞群构成了 TLS 相关的大部分免疫细胞，但 TLS 也包含不同的树突状细胞 (DC) 亚群。例如 CD21+ 滤泡树突状细胞 (FDC)，它们起源于间充质、主要定位于 T 细胞区，在 TLS 中发挥关键作用。滤泡还包含分散的 CD68+ 巨噬细胞，用于清除发生凋亡的细胞，类似于它们在 SLO 中的作用。TLS 还包含致密的基质网络，类似于由 SLO 中的滤泡网状细胞 (FRC) 形成的网络，将 TLS 锚定在慢性发炎的组织部位。最后是外周淋巴结寻址素 (PNAd) 阳性的高内皮小静脉 (HEV)， 它们为 TLS 提供了特殊的脉管系统，被认为介导了淋巴细胞的募集。

▲ TLS 的结构与功能

最近，有研究描述了癌症中存在的另一类结构化的免疫浸润。具体而言，肾细胞癌中的肿瘤内免疫或抗原呈递细胞 (APC) 生态位被定义为每 10,000 μm2 含有超过 5 个 MHC II+ 细胞的 APC 密集小区域，这些区域含有肿瘤反应性干细胞样 CD8+ T 细胞，这对小鼠模型中产生持久的免疫治疗反应至关重要。值得注意的是，APC 构造的缺失与肿瘤的进展有关，提示这些结构可能在控制肿瘤进展方面发挥着关键作用。尽管 APC 生态位与 TLS 不同，后者是由多种类型的细胞聚集而成的密布 B 和 T 淋巴细胞的较大组织结构，但目前尚不清楚 APC 构造是否反映了 TLS 形成的早期阶段。  

▲ 瘤内 APC 构造维持干细胞样 CD8 + T 细胞 （ACIR）

TLS 形成的驱动因素

次级淋巴器官（SLO）遍布全身，包括淋巴结、脾脏、扁桃体、派氏斑和黏膜相关淋巴组织。SLO 允许免疫系统从不同组织中采集抗原并将不同免疫细胞汇集于此，从而促进适应性免疫反应的诱导。在持续的慢性炎症情况下，淋巴组织会发生结外播种并在炎症部位形成 TLS。要更好地了解此类 TLS 的发展，我们可以将其与胚胎发生过程中 SLO 的形成进行对比。

SLO 的播种和组织——特别是淋巴结和派氏斑——是由一系列高度有序的事件引起的。这些事件涉及造血细胞和非淋巴基质细胞之间的相互作用，细胞因子、趋化因子、粘附分子和生存因子等分子组分在此过程中发挥着至关重要的作用。

SLO 形成是在胚胎发育早期开始于造血淋巴组织诱导 (LTi) 细胞、CD4+ CD3- CD45+ 先天淋巴细胞定植于淋巴结原基，这些细胞从胎儿肝前体分化而来，其特征在于 RORγt 和 Id2 转录因子的表达因素。LTi 细胞的聚集以依赖肿瘤坏死因子 (TNF) 家族成员的方式驱动 SLO 形成的初始步骤，其中淋巴毒素 α1β2 (LTα1β2) 和 TNF 在某种程度上起到了核心作用，因为无论是缺失 LTi 细胞还是 LTα1β2，都将阻碍淋巴结和派尔斑的形成。

LTα1β2 和 TNF 与间充质淋巴组织组织者（LTo）细胞上各自的受体 LTβR 和 TNFR1 结合，从而促进血管细胞粘附分子1（VCAM1）、细胞间粘附分子1（ICAM1）等粘附分子的表达，进而诱导黏膜寻址素细胞粘附分子 1 (MAdCAM1) 和 PNAd，以及一组称为淋巴或稳态趋化因子的趋化因子的产生（包括CCL19、CCL21和CXCL13）。随后，这些分子共同调节免疫细胞募集到淋巴生态位，以及调控 HEV 的血管形成。最后，新生淋巴滤泡的区室化是通过稳态趋化因子的分隔表达来实现的，例如，CCL19+ 和/或 CCL21+ FRCs 和 CXCL13+ FDCs 指导表达相应 CCR7 和 CXCR5 受体的淋巴细胞的分布，从而允许形成 T 细胞区和 B 细胞区。值得注意的是，淋巴趋化因子分泌诱导的正反馈回路对于维持淋巴生态位也是至关重要的，因为已发现通过在 B 细胞和 LTi 细胞上表达的 CXCR5 发出信号可诱导 LTα1β2 表达。

TLSs 显示出与 SLOs 明显的解剖相似性，尽管大多数组织中的 TLS 都缺乏周围包膜 。这种无封装结构可能允许它们的细胞成分直接进入周围组织，但也有可能使 TLS 中驻留的免疫细胞暴露于发炎微环境中的大分子。尽管 TLS 和 SLO 的形成最初被认为是由相同的分子因子诱导的，它们都具有 LTα1β2-LTβR 信号传导和粘附分子和淋巴趋化因子的局部表达的作用，但所涉及的细胞成分并不完全相同，并且推动 TLS 生成的刺激事件尚不完全清楚。

此外，许多独立于淋巴毒素信号传导的 TLS 分子诱导剂已经见诸报道。重要的是，我们对驱动 TLS 形成的细胞和分子过程的大部分理解是在自身免疫性疾病和慢性感染模型中获得的，因此在这些疾病模型中的发现只能被视为关于 TLS 形成的一种参考。

关于 TLS 的上游启动机制，我们目前尚不清楚是否需要真正的 LTi 细胞来启动局部间充质积累，或者局部聚集的免疫细胞是否可以替代 LTi 细胞。支持后一种假设的几种免疫细胞亚群——包括 Th17 细胞和先天性淋巴样细胞 3 （ILC3），这些已在小鼠和人类同种异体移植排斥、自身免疫、慢性炎症或癌症中被观察到。值得注意的是，与 SLO 形成不同，TLS 的诱导可能并不总是依赖于淋巴毒素。例如，由 T 细胞产生的白细胞介素 17 (IL-17) 可以在小鼠基质细胞中诱导 CXCL13 和 CCL19 表达，从而促进诱导支气管相关淋巴组织 (iBALT) 的形成，这是一种在肺组织中形成的 TLS。出于同样的原因，LTa-/- 小鼠中确实会形成淋巴样聚集物，尽管这些结构没有显示出 T 和 B 细胞区的分离并且缺乏 HEV，因此可能不被认为是典型的 TLS。

为了支持局部组织环境在确定 TLS 组成中的作用，已显示小鼠模型中不同细胞因子和趋化因子的转基因表达可诱导具有不同特征的 TLS。例如，CXCL13 的组织特异性表达诱导缺乏 FDC 网络的 B 细胞聚集体，而 TNF 和 CXCL12 表达诱导小淋巴细胞浸润，主要由 B 细胞、少量 T 细胞组成，在后一种情况下，DCs。此外，虽然 CCR7 配体 CCL19 和 CCL21 显示出诱导相似组成的聚集体，但由 CCL21 表达诱导的结构更大且更有组织。

在不同的人类癌症类型中，也检测到了 TLS 成分的巨大差异。例如，在 NSCLC 的 TLS 中描述了 DC-LAMP+ DC，但在其他癌症类型中描述较少。此外，TFH 细胞大多被记录在乳腺癌的 TLSs 中。然而，我们需要明确的是，现在大部分可用的数据大多来自使用缺乏一致性的 TLS 标记。因此，目前还缺乏允许对癌症之间的 TLS 异质性进行严格评估和大规模分析的参数。已有一些证据表明，特定类型的异质性特征与 TLS 成熟程度有关。基于与 SLO 的结构相似性，淋巴结构的三个成熟阶段已在 NSCLC、肝细胞癌 (HCC) 和 CRC 中被定义。组织程度最小的阶段由密集的淋巴细胞聚集组成，不存在 FDC，并且缺乏真正 TLS 特征（分离的 T 和 B 细胞区）。初级卵泡样 TLS 确实含有 FDC，但缺乏 GC 反应。相反，完全成熟的次级卵泡样 TLS 也显示出活跃的 GC，可能反映了它们的全部功能。

尽管大量工作确定了许多影响肿瘤微环境中 TLS 形成的因素，但我们对有利于或不利于 TLS 形成的局部环境的特定分子决定因素的理解或许还远未完成。作为对不发生 TLS 形成的不同肿瘤微环境进行分类的框架，我们建议将 TLS 形成被积极抑制的“限制性组织环境”与“不充分的组织环境”区分开来，其中可能缺乏必要的驱动因素，例如抗原。  

TLS 在调节肿瘤特异性免疫反应中的作用  

由于 TLS 在解剖学上与 SLO 相似，有人认为 TLS 是在发炎组织部位重现 SLO 的功能。SLOs——特别是淋巴结——通过提供一个最大化的细胞-细胞相互接触的特殊生态位，增加来自组织的载有抗原的 APCs 和来自血液的幼稚淋巴细胞的接触几率，从而提高产生适应性免疫反应的效率。

越来越多的证据表明，适应性免疫反应也可以在 TLS 中产生或得到增强。TLS 中与 B 细胞相关的主要效应功能之一是产生疾病相关的抗体，这些抗体具有标记抗原表达细胞的调理作用、补体介导的裂解作用或抗体依赖性细胞毒性。已发现 TLS 中的 GC 的形成与血清自身抗体浓度、疾病严重程度和几种自身免疫性疾病的器官功能下降相关，包括干燥综合征、重症肌无力和桥本甲状腺炎，这表明 TLSs 对疾病进展可能具有潜在的影响。

一个还未解决的重要问题是，TLS 是否主要用于重新激活或再教育效应 T 细胞，或者它们是否主要支持幼稚 T 细胞的启动。已有研究报道了与 TLS 相关的 Th17 细胞可以在自身免疫性脑脊髓炎模型中获得 TFH 细胞的表型特征，这表明效应群体的再教育可能发生在 TLS 中。另一方面，也有研究描述了在非肥胖糖尿病小鼠的胰岛中将幼稚 T 细胞募集到 TLS 中，而这种幼稚 T 细胞确实会发生原位增殖，这提示了局部免疫反应的启动。同样，在发炎的中枢神经系统中，已发现 TLS 参与了自身反应性 T 细胞对内源性髓鞘肽的反应的局部启动。此外，在小鼠中已经观察到 T 细胞和 B 细胞对病毒抗原的反应在性质上与在淋巴结中引发的反应相似，但引起的免疫病理学改变较少。在改良的痘苗病毒安卡拉模型中，已观察到在阻断淋巴细胞从 SLO 流出后引发抗原特异性 T 细胞反应。此外，在鼠黑色素瘤模型中，由 TLS 驱动的肿瘤特异性 T 细胞反应已在没有 SLO 的情况下被确定，并导致免疫细胞浸润和肿瘤消退。总的来说，这些数据提供了令人信服的证据，证明 TLS 可以在局部重现 SLO 功能。  

鉴于经典的 SLO 是有效产生抗原特异性适应性免疫反应的位点，人们也希望知道在发炎的组织部位复制淋巴样结构到底有什么作用。由于目前还缺乏有关 TLS 功能的详细信息，因此提出一些模型来解释为什么在慢性炎症条件下在感染或癌症部位创建淋巴生态位，可能会有利于我们对这个开放问题的探索（图 1）：  

• 1）速度：T 和 B 细胞池的局部启动可能会导致更快的免疫反应，因为它绕过了 DC 和淋巴细胞进出 SLO 的运输过程。与此一致，已经有人描述了幼稚 T 细胞进入肿瘤，并且依赖于小鼠模型中表达 PNAd 和 CCL21 的脉管系统的发育现象。不过，考虑到 TLS 在慢性炎症的情况下才特别明显，“速度” 论似乎不太令人信服。

• 2） 效率：局部淋巴生态位的产生可能会增加疾病相关抗原与稀有的同源淋巴细胞之间相遇的可能性，从而可能够诱导更强烈或更广泛的免疫反应。该模型中，在 TLS 和 SLO 中诱导的 T 细胞和 B 细胞的功能和表型特性可能相同，但它们靶向的抗原可以不同。

• 3）控制：拥有与发炎组织部位直接接触的淋巴生态位可能会提供引导免疫反应的额外契机。例如，肿瘤组织中产生的细胞因子和/或代谢因子可能会渗透到 TLS 中，从而影响所产生的免疫反应的性质。

• 4）存活：在一些 TLS 中存在大量功能失调的 PD-1 高表达的 CD8+ T 细胞，这是一种与肿瘤免疫反应有关的表型。在这一模型中，TLS 不仅用于诱导抗肿瘤免疫，还用于维持免疫反应。TLS 相关成纤维细胞和其他细胞亚群分泌的存活因子支持 TLS 中的淋巴细胞稳态。类似地，这可能有助于肿瘤反应性 T 细胞在肿瘤部位的长期持续存在。

为了更好地理解产生异位淋巴微生境的好处和可能的坏处，我们还需要确定在 TLS 和 SLO 中诱导的免疫反应的异同，包括它们靶向的抗原、它们各自的特性、以及抗原特异性淋巴细胞池。根据需要诱导 TLS 形成或分解的实验方法的建立，可能有助于剖析它们对肿瘤驻留免疫细胞池的影响。

图 1. TLS 对抗肿瘤免疫的潜在贡献。癌症组织中 TLS 的存在可以以不同的方式支持抗肿瘤免疫反应：(1) 速度：炎症反应部位 T 细胞和 B 细胞的启动可能会缩短产生免疫反应的时间，因为它绕过了 DC 和淋巴细胞从 SLO 到效应部位之间的运输。(2）效率：局部淋巴生态位的形成可能会促进更强或更广泛的免疫反应的诱导，因为淋巴细胞遇到同源抗原的几率更高。(3) 控制：将 TLS 相关免疫细胞直接暴露于发炎的组织环境中，可以微调针对特定输出信号的免疫反应。(4) 存活：促进淋巴细胞稳态和存活，既可以通过 TLS 相关细胞群分泌的存活因子，也可能通过效应 T 细胞与 APC 大反复接触。  

TLS 的预后预测潜力  

TLS 与许多癌症类型的良好预后有关，并且 TLS 的预后价值通常与 TNM 分期无关。例如，在肺癌、结直肠癌和胰腺癌中的记录表明， TLS 密度及其成分的存在（TFH 细胞、滤泡 B 细胞、DC-LAMP+ 成熟 DC 和 HEV 等）与许多不同肿瘤类型的更好的存活率相关。此外，与 TLS 相关的多个特征基因集已显示出积极的预后预测价值，包括卵巢癌中的浆细胞特征；头颈部鳞状细胞癌中的 TFH 特征；CRC、黑色素瘤和乳腺癌中与淋巴趋化因子相关的各种基因特征（包括 CCL5、CXCL9、CXCL10 和 CXCL13）。此外，肿瘤中 TLS 的存在通常伴随着免疫浸润的普遍增加。例如，在人类 NSCLC 和三阴性乳腺癌中，与单独的 CD8+ T 细胞浸润相比，TLS 和活跃的肿瘤内 CD8+ T 细胞浸润的组合可以更好地预测更好的预后，并且这一观察已被用作预测肿瘤中产生的优质免疫反应的证据。  

我们很容易将观察到的相关性解释为 TLS 在诱导或维持肿瘤特异性免疫中的核心作用的证据，但同样非常重要的是认识到 TLS 的形成似乎依赖于抗原识别。因此，观察到的预后价值可能部分通过 TLS 的形成表明存在正在进行的免疫反应这一事实加以解释。为了进一步了解这个问题，比较存在于含有或缺乏 TLS 的肿瘤中的反应性 T 细胞的状态可能也非常有意义。此外，我们还需要确定影响小鼠模型中 TLS 形成的（肿瘤）细胞参数是否与抗原负荷无关，以随后测试它们对肿瘤控制的影响。  

尽管 TLS 通常与大多数癌症类型的良好预后相关，但 TLS 的存在与某些癌症类型的肿瘤发展或进展有关。已有多种潜在的免疫抑制机制可以解释这一观察结果。首先，主要存在于 TLS 中的 Treg 的消耗改善了小鼠肺腺癌模型中的肿瘤控制，这表明 TLS 相关的 Treg 可能抑制内源性抗肿瘤 T 细胞反应。其次，除了作为肿瘤特异性抗体产生者，TLS 驻留的 B 细胞还可能通过分泌 IL-10等机制抑制肿瘤特异性免疫。此外，根据产生的抗体同种型和存在的免疫细胞类型，肿瘤特异性抗体还可以通过抑制性 Fc 受体发出的信号来抑制肿瘤特异性免疫反应。最后，基于 HCC 祖细胞在离开和形成肝肿瘤之前先出现在 TLS 中的现象，TLS 已被建议作为可能促进恶性细胞转化和生长的微生态标志。同样地，人类乳腺癌的 TLS 中也检测到了癌细胞簇，它们的存在与淋巴浸润和更高的淋巴结分期有关。尽管上述观察结果为 TLS 组成和功能的异质性提供了证据，但促进肿瘤进展的“抑制性” TLS 的直接证据仍然有限。开发原位特异性改变 TLS 属性的研究方法，可以提供解决此类因果关系问题的有效的实验手段。

最近的一些研究也提供了 TLS 对 ICB 反应的预测价值的证据。具体而言，在黑色素瘤、肾细胞癌、软组织肉瘤和尿路上皮癌的预处理活检中，发现 TLS 和活跃的 B 细胞浸润与对 PD-1 或联合 PD-1 加细胞毒性 T 淋巴细胞相关蛋白 4 (CTLA-4) 阻断有加成作用。同样地，大量 TLS 成分的存在，包括记忆样 B 细胞和浆母细胞样细胞，在黑色素瘤中 ICB 反应者的预处理活检组织中富集。此外，主要定位于 TLS 内的 PD-1 高表达的功能失调 CD8+ T 细胞的存在，被证明可以预测晚期 NSCLC 对 PD-1 阻断的反应。有趣的是，TLS 丰度与免疫细胞上的 PD-L1 表达相关，但与肿瘤细胞上的 PD-L1 表达无关。

另一方面，对治疗中肿瘤活检的分析表明，ICB 治疗也可以促进 TLS 的形成。在高危型黑色素瘤和尿路上皮癌中使用新辅助 ICB 后，响应患者的肿瘤观察到更高数量的 TLS 相关的 B 细胞。在几项探索性的 NSCLC 新辅助 PD-1 阻断研究和尿路上皮癌中 PD-1 加 CTLA-4 阻断的研究中，已观察到消退肿瘤病变中 TLS 的增加。同样，ICB 治疗增加了小鼠黑色素瘤模型中 TLS 的数量和大小，这与更好的肿瘤控制相关。考虑到 TLS 在促进抗原特异性 T 和 B 细胞反应中的作用，可以推测 ICB 不仅增强了 TLS 的形成，还增强了 TLS 的功能。尽管许多观察结果与 ICB 影响 TLS 功能的模型一致，但这些都属于间接证据。在开始治疗后的早期时间点（数小时至数天）对肿瘤进行空间分析，或分析 ICB 处理的离体人类肿瘤培养物，应该有助于进一步直接解析这个问题。 

图2. 癌症治疗对 TLS 的潜在影响。已发现几种治疗策略可诱导或促进癌症中 TLS 的形成。例如，新辅助化疗被证明可促进 NSCLC和肝母细胞瘤中 TLS 的从头发展。类似地，癌症疫苗被证明可以促进胰腺癌或 CIN2/3 病变中 TLS 的形成。尽管 ICB 已被证明可以增加多种癌症类型中 TLS 数量，但目前尚不清楚其是否也能诱导新生 TLS 形成。此外，ICB 也可能通过促进效应和记忆 T 细胞的生成、TFH 细胞和 B 细胞类别转换的诱导来增强小鼠和人类的 TLS 功能。基于这些现象，或许 ICB 也可以诱导 TLS 成熟，不过目前还缺乏直接证据。  

TLS 的治疗性诱导  

鉴于在许多报道中 TLS 与疾病结果之间的关联，TLS 的诱导可能形成一种富有吸引力的治疗策略。通过 TLS 相关细胞因子和趋化因子的组织特异性表达诱导局部 TLS 的可行性已在小鼠模型中得到证实，包括淋巴毒素、TNFα、LIGHT、CXCL13、CCL21、CCL19 和 CXCL12。此外，在乳腺癌和神经内分泌胰腺癌的小鼠模型中获得了 TLS 可以在治疗过程中被诱导并与肿瘤控制相关的证据，其中 PD-L1 阻断与抗血管生成疗法的结合导致肿瘤血管转化为 HEV，随后 TLS 形成并增加的 CD8+ T 细胞对肿瘤细胞的杀伤。另外，已有研究者在人类癌症中观察到独立于 ICB 的 TLS 诱导途径（图 2）。例如，在患有高级别宫颈上皮内瘤变 (CIN2/3) 的患者中接种针对人乳头瘤病毒癌蛋白的疫苗后，可以在消退后的病变组织中观察到 TLS 的形成和 TLS 的克隆扩增。同样，用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子分泌胰腺肿瘤疫苗 (GVAX) 联合环磷酰胺进行治疗性疫苗接种，导致绝大多数胰腺癌患者形成了 TLS。这些不同类型的疫苗接种中观察到的 TLS 诱导提供了强有力的证据表明，抗原特异性免疫反应的强度是人类疾病中 TLS 形成的决定性因素。常规疗法对 TLS 的形成也有影响，例如在 NSCLC 和APC 基因突变相关的肝母细胞瘤的新辅助化疗中已经观察到 TLS 的诱导。值得注意的是，鳞状细胞肺癌出现了相反的现象，有报道表明新辅助化疗导致 TLS 成熟障碍和 GC 丢失。此外，在肺癌和尿路上皮癌的类固醇治疗（通常与化疗同时使用）后也出现了类似的结果。目前尚不完全清楚对 TLS 组织的负面影响是否取决于所使用的化疗类型或伴随的类固醇治疗。

值得考虑的一个重要因素是，尽管诱导或增强 TLS 功能可能会改善肿瘤控制，但此类干预也可能同时增强其他组织部位的自身反应性 T 和 B 细胞反应。自身免疫反应被观察为 ICB 治疗的主要毒副反应类型，这些所谓的免疫相关不良事件类似于自身免疫性疾病中的常见炎症过程，包括关节炎、肌炎、甲状腺炎、血管炎和结肠炎。考虑到已发现 TLS 在许多自身免疫性疾病中支持局部炎症过程，因此提高 TLS 数量或 TLS 功能的方法也可能增加 ICB 诱导的自身免疫毒性。尽管目前关于 TLS 在免疫相关不良事件中的作用的数据很少，但已有报道称 TLS 形成与 PD-1 阻断后的自身免疫性肌病之间存在关联。具体而言，抗 PD-1 治疗后对出现了肌痛和肌肉无力的患者进行活检，结果显示 CD8+ T 细胞驱动的肌肉组织破坏与表达 PNAd 和 CCL21 的 TLS 样结构的形成有关。因此，诱导或增强 TLS 功能虽然可能有助于促进抗肿瘤反应，但也可能促进自身反应性 T 和 B 细胞的扩增，因此未来的临床应用需要仔细评估这些方法的风险效益比。

全文总结

最近描述 TLS 在癌症中的预后和预测价值的研究激发了人们对这些结构作为抗肿瘤免疫的潜在手段的兴趣。现有证据表明，TLS 有助于增强肿瘤特异性免疫反应是合理的。然而，我们仍不清楚该现象到底是因为 SLO 中产生的 T 细胞反应的增强，还是由于新 T 和 B 细胞抗肿瘤反应性优化。类似地，肿瘤部位 TLS 的存在为通过局部因子导致不同性质的免疫反应提供了明确的可能性。然而，目前还缺乏在 TLS 中形成或增强的免疫反应的独特性质的直接证据。TLS 已在多种癌症类型中的研究结果表明其预后预测价值毋庸置疑，但我们还缺乏一致的标志物来定义和表征 TLS，而这将成为该领域未来需要关注的一个方向，从而最大限度地发挥 TLS 作为潜在生物标志物的价值。与此相关，根据细胞组成、位置、成熟度和功能等方面的特征，提供对 “TLS 状态” 谱的更全面的定义（图 3），可能有助于更好地理解它们在癌症控制中的作用，而明确 TLS 状态的分子水平的特征，则有助于提高 TLS 作为预后预测标志物的价值。最后，更详细地理解 TLS 的功能及其在自身免疫毒性中的潜在作用，将有助于充分发掘 TLS 作为多种慢性疾病的治疗靶点的潜在价值。  

图 3. 定义 TLS 的状态。使用一致的参数对 TLS 状态进行全面的分子定义，有助于提高其作为预后预测生物标志物的价值。更深入地解析 TLS 状态存在的方面包括，细胞组成、位置和成熟度；细胞因子和趋化因子微环境的分子特征；以及 TLS相关的 B 细胞受体 (BCR) 和 T 细胞受体 (TCR) 库。AID，活化诱导的胞苷脱氨酶；CTL，细胞毒性 T 淋巴细胞；Ig，免疫球蛋白。  

参考文献： 

Aloisi F, Pujol-Borrell R. Lymphoid neogenesis in chronic inflammatory diseases. Nat Rev Immunol. 2006 Mar;6(3):205-17. doi: 10.1038/nri1786. PMID: 16498451.

Munoz-Erazo L, Rhodes JL, Marion VC, Kemp RA. Tertiary lymphoid structures in cancer - considerations for patient prognosis. Cell Mol Immunol. 2020 Jun;17(6):570-575. doi: 10.1038/s41423-020-0457-0. Epub 2020 May 15. PMID: 32415259; PMCID: PMC7264315.

Schumacher TN, Thommen DS. Tertiary lymphoid structures in cancer. Science. 2022 Jan 7;375(6576):eabf9419. doi: 10.1126/science.abf9419. Epub 2022 Jan 7. PMID: 34990248.

* 推文用于传递知识，如有版权等疑问，请于本文刊发30日内联系BiG生物创新社。