医微客 - 苏海翔 | 肿瘤免疫治疗与疗效监测生物标志物临床价值及其检测方法

苏海翔 | 肿瘤免疫治疗与疗效监测生物标志物临床价值及其检测方法 · 述评

临床研究

2022-09-06

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前言：

免疫治疗（Immunotherapy）在肿瘤治疗中发挥着越来越重要的作用，但目前还只有少数患者可从中获益，离全社会实现“治愈癌症”的目标要求还有很大距离。从这一方面说明免疫系统的复杂性和高度可调节性，另一方面也提示我们需要积极寻找可为临床免疫治疗决策和疗效预测提供有效手段，帮助临床医生更好地理解肿瘤和免疫系统之间复杂的相互作用及诊疗监测的生物标志物。本文对与肿瘤免疫治疗疗效相关的预测性生物标志物的研究进展和检测方法概述如下。

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作者：苏海翔王涛

(一) PD-L1

1.PD-L1的生物学和抗PD-L1治疗：PD-L1及其同源受体PD-1是免疫抑制轴的组成部分。肿瘤细胞可以通过两种不同机制激活该通路，一是基因组改变，二是获得性免疫抵抗[7]。阻断PD-1/PD-L1，可使T细胞和效应器的功能重新被激活，杀伤肿瘤细胞，使患者获益[8]。Khunger等对41个PD-1/PD-L1抑制剂相关的临床试验进行荟萃分析后发现，肿瘤细胞和免疫细胞中PD-L1阳性几乎可以预测所有不同肿瘤对免疫治疗有良好反应，PD-L1高表达与抗 PD-L1 治疗更大的获益有关[9]。FDA 已经建立了一个新的诊断类别，称为补充诊断（complementary diagnostic），定义为“一种有助于治疗产品使用的效益风险决策的诊断，其中效益风险的差异具有临床意义”[10]，并已将PD-L1指定为某些特定PD-L1抑制剂适应症预期用途的补充诊断以及其他用途的辅助诊断。

2.PD-L1的检测：目前PD-L1的临床检测基本均采用免疫组化（Immunohistochemistry, IHC）技术。基于不同单克隆抗体（22C3，28-8，SP142，SP263，73-10）的一些PD-L1检测方法已获得 FDA 批准，在评价检测结果时要充分考虑单抗-药物、检测方法、cutoff值等问题，不同单抗-药物的评分标准和阳性阈值有所不同。

在PD-L1检测和结果解读时要特别注意一致性问题。蓝印项目（The Blueprint Project）是由国际癌症研究协会赞助的一个行业学术合作项目，旨在评价各种 PD-L1检测分析的一致性。该项目第一阶段检查了3名病理学家用4种单抗对39例非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）患者进行的PD-L1评分，结果显示：22C3、28-8和SP263具有可比性，而SP142远低于其他3种。第二阶段扩展到81例其他组织类型肺癌，22C3、28-8和SP263再次显示出高度可比的染色结果，而SP-142显示出较低的肿瘤细胞染色比例；与其他抗体相比，73-10的灵敏度更高[10]。Rimm等[11]对用28-8、22C3、SP142和E1L3N单抗进行的PD-L1 IHC分析进行了前瞻性、多机构、基于病理学家的一致性评价，28-8、22C3和E1L3N分析与蓝印项目的研究结果基本一致；SP142检测与肿瘤细胞中PD-L1表达评分显著降低相关。不同检测方法之间的重复性对肿瘤细胞PD-L1表达非常好，但对免疫细胞PD-L1表达较差。Munari等[12]对198例NSCLC患者的样本进行了22C3和SP263克隆检测的结果比较，结论是这2种检测方法不可互换。

在PD-L1结果分析中还需要注意肿瘤异质性等对检测结果的影响。Ilie等对NSCLC患者手术切除标本和配对的活检标本之间的PD-L1进行了比较研究，结果发现，不一致率高达约50%；大多数差异显示同一患者的活检标本中PD-L1表达为阴性，手术切除标本中PD-L1表达为阳性；75% 的不一致是由对免疫细胞的评分差异引起的[13]。另外，放疗、化疗和小分子激酶抑制剂治疗可能诱导PD-L1表达，造成治疗前后PD-L1检测结果的差异[14-16]。

总体上看，影响PD-L1检测结果的因素很多。在生物学方面需要注意胞间及胞内的异质性、可诱导性、动态表达（治疗前后）、细胞类型（免疫细胞，肿瘤细胞）、染色部位（胞外与胞内）。在检测技术方面需要注意表位稳定性、分布（聚集与弥散）、不同的检测用单抗和平台、不同的阈值、判读者的主观性。在组织来源方面需要注意组织类型（存档标本与新鲜标本）、原发部位与转移灶、细胞学标本、组织获取的难易程度、组织标本的质量、不同肿瘤PD-L1表达与疗效关系的不一致性。与这些问题相应，在PD-L1检测标本的质量要求、标准化判读标准、报告标准规范等方面也还有大量的工作需要去做。

（二）MMR 和 MSI

1.DNA 错配修复 (mismatch repair，MMR)和微卫星不稳定性 (microsatellite instability，MSI)的病理生理：MMR 系统可识别并修复DNA复制过程中发生的插入、缺失和碱基对错配。MMR缺陷由4种主要修复蛋白（MLH1、MSH2、PMS2、MSH6）中的一种或多种失活引起。错配修复缺陷（mismatch repair deficiency, dMMR）可遗传或散发，造成基因组错义突变和微卫星区域长度的变化[17-18]。在成人恶性实体肿瘤中有4%为dMMR[19]，dMMR频率较高的肿瘤包括子宫内膜癌、胃癌、小肠癌、结直肠癌等[19-20]，MLH1和MSH2失活约占遗传性dMMR病例的90%[21]。MMR的遗传缺陷是遗传性非息肉病性结肠癌（Lynch综合征）的原因，尤其易患结直肠癌（Colorectal cancer，CRC）和子宫内膜癌，风险分别为52%~82%和25%~60%[22-23]。

MSI也称为短串联重复或简单序列重复。在DNA复制过程中，复制DNA链的瞬时解离和随后的错位重排可导致微卫星长度的改变[24]，这些改变通常由MMR系统进行修复，但在dMMR中，修复出现问题，导致MSI，因此，MSI是 dMMR 的结果。如果肿瘤和正常组织中存在相同数量的DNA重复序列，被认为是微卫星稳定；相反，则判定为MSI。不稳定程度分为3种，MSI高（MSI-H）、MSI低（MSI-L）和微卫星稳定[25]。1998年，美国国家癌症研究所根据2个单核苷酸标记（BAT25和BAT26）和3个二核苷酸标记（D2S123、D5S346和D17S250）建立了大肠癌MSI检测的国际标准[26]。随后，又提出了一个包含5个单核苷酸标记（BAT-25、BAT-26、NR-21、NR-22、NR-24）的补充，敏感性（95.8% vs 76.5%）和阳性预测值（88.5% vs 65.0%）更高[27]。

2.MMR 和 MSI与肿瘤的免疫治疗：dMMR和MSI检测已被FDA确定为PD-L1免疫疗法适应症的强制性检验项目。Le等人在评估帕博利珠单抗在dMMR或MMR无缺陷（MMR proficient，pMMR）CRC患者疗效的2期临床试验中发现，dMMR与pMMR患者的客观缓解率（objective response rate，ORR）存在显著差异，dMMR 患者的ORR为40%，pMMR 患者的ORR为0%；dMMR 非CRC患者，包括壶腹癌、子宫内膜癌、小肠癌和胃癌患者，也有较高的获益率，ORR为71%[28]。FDA批准的有关 dMMR 肿瘤免疫治疗的药物有帕博利珠单抗和纳武单抗[29-30]。

3.MMR 和 MSI检测方法：检测MMR功能缺陷的方法主要有两种：IHC和多重荧光 PCR-毛细管电泳法。IHC用来检测MMR蛋白缺陷[31]；多重荧光 PCR-毛细管电泳法主要用来检测MSI[32]，每种方法都有自己的局限性。IHC取决于样本固定条件和准确的结果解读；MSI需要正常组织对照来作比较。从分析角度来看，两种方法性能相当，假阴性率均约为5%~10%[33]。IHC在检测抗原完整但功能不活跃蛋白质的突变（如MLH1）中可能出现假阴性；MSI在肿瘤内异质性和解剖不到位的情况下可能出现假阴性[34]。选择哪种方法通常取决于成本、可用性和周转时间等因素。

MSI也可以用NGS方法来评估，与PCR方法相比，用NGS评估MSI具有良好的敏感性和特异性[35-36]。NGS分析中必须包括微卫星区域，使用能够确定这些区域大小的生物信息学算法，并考虑由于体外聚合酶滑动引起的正常样本中微卫星区域大小分布的改变。基于捕获和PCR文库制备的MSI检测灵敏度一般为96.4%~100%，特异性为97.2%~100%[37, 38]。NGS分析的明显优势是能够将MSI分析与更广泛的基因组分析结合起来，无需额外的测试或消耗额外的组织材料。

（三）TMB

1. TMB在肿瘤免疫治疗中的作用：肿瘤突变负荷（tumor mutational burden, TMB）是衡量体细胞癌变患病率的指标，通常表示为每兆碱基中的突变碱基数。TMB在不同肿瘤类型之间和内部都存在显著差异，其中黑色素瘤、肺癌和膀胱癌的突变率最高[39]。虽然TMB与dMMR和MSI 有关，但并不完全重叠；大多数dMMR/MSI-H肿瘤有高TMB，但并非所有高TMB 肿瘤都是dMMR/MSI-H[38]，所以，TMB是独立的，不能与dMMR或MSI互换。

TMB高的肿瘤对免疫治疗的响应也高。Snyder等[40]在黑色素瘤研究中发现，高TMB与 ipilimumab 或 tremelimumab 为基础的 CTLA-4抑制剂的持续临床疗效相关；但作者也指出，部分高TMB患者并没有获益。Goodman等[41]在回顾性分析中发现，TMB是151例患者、多种免疫器官以及20多种不同类型肿瘤（乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌、前列腺癌和肾癌等）的独立预后因子。

PD-L1状态和TMB 是独立的生物标志物，但在预测患者是否可能获益于免疫检查点抑制剂治疗方面具有明显的叠加效应。Carbone等[42]在Checkmate 026 第三阶段的研究中发现TMB和PD-L1表达水平均较高患者（75%）的治疗应答率高于单项标记物升高的患者（TMB为32%，PD-L1为34%）或2种标志物水平均较低的患者（16%）。Hellmann等在 Checkmate 227和 Checkmate 012试验中也发现PD-L1表达阳性>1%、TMB高于中位数的NSCLC患者，与只有1个或2个变量的患者相比，联合使用Nimab和Ipilimumab的治疗响应和无进展生存率明显要高[43-44]。2017年，NEJM发表的统计数据汇总了27种肿瘤中TMB的大小与PD-1抑制剂治疗的有效率关系，结果表明不同类型的肿瘤中TMB大小不同，TMB越大，PD-1/PDL1抑制剂有效率越高[45]。

2.TMB的检测:目前，常规开展TMB临床检测还存在一些问题，其中最关键的是准入、技术/分析成本、计算方法和报告模式的标准化。大多数研究报告中采用的是全外显子测序（whole-exome sequencing，WES）方法，成本高、分析负担重，在临床广泛应用还有困难。靶向NGS技术在TMB 检测中比较有前景，当与恰当的生信分析方法相结合时，可提供精确而实用的检测和计算TMB的方法。Rizvi等对靶向NGS和WES技术的TMB检测结果进行比较，发现2种方法之间有很强的相关性[46]。Chalmers等[47]发现，1.1兆碱基的靶向NGS与WES方法确定的TMB密切相关（R2=0.74），筛选出种系变异和罕见变异对确定准确的TMB至关重要。基于NGS 方法准确评估TMB的能力取决于测序的靶区大小。

以血液为基础的非组织样本TMB评估方法正在探索之中。Gandara 等[48]研发了一种基于血液的TMB检测方法，该方法用394个基因的单核苷酸变异计算TMB，样本为血浆中的cell-free DNA，结果表明以血液为基础的TMB分析预测免疫抑制剂临床获益独立于PD-L1。以血液为基础的检测方法作为组织为基础的TMB检测的替代方法，将为临床常规开展TMB评估提供许多便利。

（四）POLE和POLD1突变

1. POLE和POLD1的生物学：聚合酶ε（编码POLE）和聚合酶δ（编码POLD1）是参与细胞周期 S 期中 DNA 复制的 DNA 聚合酶[49]。这些酶还具有DNA校对和修复功能，通过其核酸外切酶域可以删除和替换错误的碱基并延续DNA复制，核酸外切酶域的突变可扰乱校对和修复功能，导致基因组突变积累，通常被称为超突变体表型。包括约3%的CRC和7%~10%的子宫内膜癌在内的许多肿瘤中都存在与超突变体表型相关的POLE突变[50]。与dMMR一样，POLE突变的肿瘤常有高TMB、炎症微环境、高PD-L1表达，与免疫治疗获益相关。POLE突变主要发生在微卫星稳定/pMMR 肿瘤中，但也有研究在MSI病例中发现了POLE突变，可以解释一些不明原因的Lynch综合征表型[51]。POLD1突变比POLE突变少，在dMMR肿瘤中更为常见。

2.POLE和POLD1突变对肿瘤免疫治疗的影响和检测：鉴于与POLE突变肿瘤相关的高TMB、炎性微环境以及免疫检测点的上调，有充分的科学依据来评估免疫治疗在这种环境下的效果；如果有效的话，将使1%~3 %的目前没有给予免疫治疗的CRC患者受益。

POLE突变检测方法有靶向NGS或等位基因特异性PCR，2种检测方法都聚焦在3个周期性突变位点 (P286R/H/S，V411L，S459F)上，这些突变代表了90% 的已知核酸外切酶域的突变[52]。

（五）TIL评估和多重免疫表型分析

肿瘤中浸润的淋巴细胞（tumor infiltrating lymphocytes, TILs）是肿瘤炎症微环境的表现，已被公认为预测肿瘤免疫治疗响应的生物标志物。2011年，Mahmoud等[53]首次提出将TILs作为乳腺癌的预后因素，他们发现，肿瘤浸润性CD8+淋巴细胞丰度与患者的临床结局间有明显关联，并不受肿瘤分级、分期和Her2状态等因素的影响。

在对I-IV期CRC的研究中，Mlecki 等[54]发现，肿瘤中心和边缘侵袭的CD8+ T淋巴细胞在评估肿瘤复发中的作用优于TNM分期。Smyrk 等[55]提出了TILs 可作为筛选需要进行MSI检测的结肠癌样本的标准。当用 TILs = 5 为cutoff 值时，MSI-H的敏感度为93%，特异度为62%；假设 MSI-H率为12%，用TILs作为筛选指标，可以减少对50%以上的结肠癌样本再进行MSI 检测，对MSI-H的识别率仍可高达93%。在治疗过程中进行的活检组织检查中还观察到，与治疗无响应者相比，有响应者肿瘤中心与肿瘤边缘的 CD8+ T细胞增多，提示治疗可能诱导肿瘤区域的T细胞浸润[56]。

虽然大量研究结果证明了TILs作为肿瘤免疫治疗生物标志物的重要潜力，但在临床实践中对TILs的评估和解读目前还缺乏强有力的方法与工具。针对临床 TILs 评估的标准化、可重复性需要，Hendry等[57]代表国际免疫肿瘤标志物工作组（The International Immunooncology Biomarkers Working Group）提出了一种基于苏木精－伊红的方法，用于实体肿瘤TILs评估。国际TILs工作组也发表了在乳腺癌进行TILs 评价的方法学建议[58]。基于计算机图像分析的 TILs 评分方法[59]、原位多重标记技术[60]、单片多重IHC连续染色技术[61]、荧光多重染色技术[62]等都为临床实验室TILs的评估和解读的标准化带来了希望。

（六）癌症新抗原

dMMR、MSI-H、TMB与免疫检查点抑制剂临床获益间的相关性是一种概率关系。在这种关系中，高TMB增加了产生有效T细胞免疫应答新抗原的可能性[63]，因此，dMMR、MSI-H 和TMB都被认为是免疫原性新抗原的替代检测指标。

在黑色素瘤和NSCLC患者中，较高的新抗原负荷与免疫检查点抑制剂治疗的响应相关[64]。在大部分恶性肿瘤中，已证实T细胞对I类和II类组织相容性复合物限制的新抗原都有反应[65]，但事实上只有一小部分的肿瘤突变可形成宿主T细胞能够识别的新抗原[66, 67]。免疫反应性肿瘤新抗原可能源自基因组中任何基因的突变，但在与肿瘤发生相关的肿瘤驱动基因中却并不常见[68]。

Steven Rosenberg建立了一种串联式微型抗原检测方法，用于从接受过继细胞移植治疗的患者体内准确识别出新抗原[69]。用这种技术，在31个黑色素瘤中有29例被鉴定出新抗原 (94%)，并且每一种新抗原都是患者自身所特有的[70]；在75例胃肠道肿瘤中，有62例 (83%) 发现了新抗原，其中 99%也是患者自身特有的[69]；在转移性乳腺癌[71]和人类乳头状瘤病毒相关的转移性宫颈癌[72]中，也发现了与过继细胞移植相关的免疫原性肿瘤抗原。

目前，对肿瘤新抗原频率和独特性的深入了解不够、缺少合适的生信和实验室检测方法等问题都限制了肿瘤新抗原检测在抗肿瘤免疫治疗获益评价中的临床实际应用。

（七）抵抗癌症免疫治疗的生物标志物

虽然免疫治疗为肿瘤患者提供了前所未有的获益机会，但多数患者对免疫治疗表现出原发抵抗，部分患者在治疗过程中出现继发性抵抗。

Zaretalsky等[73]在2个初期对帕博利珠单抗治疗有响应、后期进展的黑色素瘤患者发现 Jak1和 Jak2突变。Jak1/2基因突变导致 IFN-信号及其抗肿瘤细胞增殖作用的缺失。

Shin等[74]确认Jak1/2突变是CRC和黑色素瘤患者对抗 PD-1治疗原发耐药的原因，并证明这些突变既可以导致原发性也可以导致继发性的免疫治疗耐药。HLA1类抗原加工和递呈机制损伤可能是肿瘤免疫治疗耐药的另一种机制。

Gettinger等[75]在14名继发性免疫检查点抑制剂抵抗的肺癌患者中发现了1例β2-微球蛋白 (β2-M) 纯合性缺失患者，β2-M对于HLA1类复合体的正常功能至关重要。一些传统细胞信号通路的缺陷也与免疫治疗抵抗有关，这些通路可能影响免疫调节。

与负性免疫调节有关的通路和基因组改变包括-catenin的活化[76]、 PTEN丢失[77]、 EGFR突变和 ALK重排[78]，这些通路和免疫激活/抑制之间的联系为靶向治疗和免疫治疗的联合提供了强有力的理论基础。对免疫检查点抑制剂治疗原发抵抗的黑色素瘤显示一种与先天性抗PD-1耐受的特殊转录信号特征。Hugo等[79]发现，这种转录信号是以增强参与细胞外间质重塑、血管生成、伤口愈合、细胞黏附和间质转化调节相关的基因表达为特征的。在肺腺癌、CRC、肾透明细胞癌和胰腺癌中也发现了先天性抗PD-1抗性标志的激活。

对癌症-免疫相互作用结果的认识基于多种参数，每个独立参数在患者之间可能不同。Blank等[80]提出了一个“癌症免疫图谱”框架，可用于全面了解免疫反应和抗免疫机制。“癌症免疫图谱”包括了7个基础参数：肿瘤来源、一般免疫状态、免疫细胞浸润、免疫检查点缺失、可溶性抑制剂缺失、抑制性肿瘤代谢缺失以及对免疫效应器的敏感性情况。当这7个参数中任何一个处于不利状态时，都可能预示免疫治疗耐药。这种免疫图谱或类似工具在肿瘤免疫治疗临床中的应用需要多领域专家的合作，以实现肿瘤基因组、免疫组化和外周血数据等多因素的整合。

（八）微生态

人体的微生态是由数以万亿计的生活在皮肤、黏膜表面和肠黏膜上的微生物组成的。最近的一些研究数据证实：微生态可能作为肿瘤免疫治疗反应的生物标志物[81-82]。

Routy等[83]进行了肠道微生态和对免疫检查点抑制剂反应之间的相关性研究，发现在抗PD-1/PD-L1治疗之前使用广谱抗生素治疗的NSCLC和尿路上皮癌患者的OS和PSF明显缩短。他们发现肠道微生态的多样性与免疫抑制剂治疗响应相关，同时发现了治疗有响应者与无响应者的特异性细菌富集属，其中嗜粘蛋白阿克曼菌（A. muciniphila）与良好的免疫治疗响应间有最显著关联，可能与A. muciniphila能加强肠道屏障的完整性、减少全身炎症并改善免疫相关。

Gopalakrishnan 等[84]在一个前瞻性研究中收集了抗PD-1治疗前的转移性黑色素瘤患者的样本，样本中肠道微生态的多样性在有应答者中显著高于无应答者，并且微生态的多样性与PSF延长相关。梭状芽孢杆菌目（Clostridiales order）、瘤胃球菌科（Ruminococcaceae family）、粪便杆菌属（Faecalibacterium genus）在抗 PD-1治疗有响应组更为丰富，Bacteroidales order在无响应组更为丰富。在机制探索中，他们发现了肿瘤中CD8+ T细胞浸润丰度与粪便杆菌属、瘤胃球菌科和肠道梭状芽孢杆菌目的数量之间存在统计学意义上的显著相关，提示通过增强抗原递呈和改善效应细胞功能可以增强机体的抗肿瘤响应。粪便移植研究结果表明，与治疗无响应组粪便移植小鼠相比，将响应组小鼠的粪便移植到抗PD-1治疗的小鼠后，CD8+ T细胞浸润密度升高，对免疫检查点阻断治疗的响应更强。

这些研究结果均提示，良好的肠道微生态和免疫检查点抑制疗法之间的因果关系，证明了肠道微生态的多样性和组成可以作为肿瘤免疫治疗响应的生物标志物，调节肠道微生态可能对接受免疫检查点抑制剂的肿瘤患者有益。

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