肝内胆管癌（ICC）是一种起源于胆管上皮细胞，侵袭性较强的恶性肿瘤，是胆道肿瘤（BTC）的一种。目前手术切除是唯一可能治愈ICC的方法，但并不适用于晚期患者。吉西他滨联合顺铂（GemCis）和其他基于吉西他滨的化疗方案为晚期ICC患者一线治疗方案，近期，已有BTC患者接受免疫联合化疗获益相关研究报道。TOPAZ-1研究中，PD-L1抑制剂度伐利尤单抗联合GemCis与GemCis化疗相比，能够提高约10%-26.7%的响应率，但与BTC患者接受免疫联合化疗疗效相关的预测因素还未得到深入探索，筛选适合免疫联合化疗的人群还需进一步明确。

近日，东方肝胆医院肿瘤科与先声诊断合作，使用NanoString-RNA免疫微环境检测工具，分析了接受免疫联合GemCis一线治疗晚期ICC应答组和非应答组患者基线肿瘤组织样本免疫微环境特征差异，开发了免疫相关基因标签，具有良好的疗效预测价值。本研究将有助于深化对ICC免疫联合治疗的认识，文章近期发表在免疫学主流期刊Frontiers in Immunology 杂志（IF=8.786）[1]。

研究结果

1.  吉西他滨为基础的化疗可诱导免疫原性细胞死亡

研究回顾性分析了公共数据库中胆管癌患者接受免疫联合化疗方案的获益情况，结果提示免疫联合化疗可以提高ICI的治疗疗效（图1A）。研究分析了接受以Gem为基础化疗处理48小时TFK1细胞的免疫原性，结果发现约50%的细胞死亡。RT-PCR实验证明基于Gem的化疗可以诱导I型IFN （IFNA1）和趋化因子（CXCL10，CXCL11）的表达（图1B）。同时，基于Gem的化疗提高了细胞表面钙网蛋白（CRT）的表达（图1C）和ATP、HMGB1的释放（图1D,E）。研究也发现基于Gem的化疗在转录水平（图1B）和蛋白质水平（图1F, G）均可诱导肿瘤PD-L1的表达。因此，以Gem为基础的化疗可以诱导肿瘤细胞的免疫原性细胞死亡和PD-L1的高表达，这可能有助于增强ICIs的疗效。

图1. 吉西他滨为基础的化疗可诱导免疫原性细胞死亡  

2.  接受免疫联合化疗治疗的ICC患者的基线特征

12个ICC患者的基线特征如表1所示。如表中所示，大部分是晚期肝外转移以及乙肝感染患者。

表1. 入组患者基线特征

3.  患者基因组突变谱特征

研究将患者分为应答组（定义为与患者基线病灶相比，任何程度的肿瘤缩小）和未应答组（图2A），生存分析结果显示，应答组和未应答组PFS有显著差异（13.2个月Vs. 3.45个，p = 0.0448）（图2B）。应答组与未应答组基线基因突变图谱分析显示，两组之间有相似的基因突变特征，即P53和KRAS突变是最常见的基因突变，也检测到IDH1突变和FGFR2融合两种常见的ICC治疗靶点。同时患者基线肿瘤的中位TMB为3.195 Muts/Mb，两组间TMB没有显著性差异（图2C）。

图2. 患者基因组突变谱特征

4.  应答组与未应答组PD-L1表达差异以及免疫细胞类群差异特征

多重免疫荧光分析结果显示（mIF），与其他研究中研究队列相比，本研究队列PD-L1表达水平显著较高 （图3A）。然而没有观察到PD-L1表达与免疫应答之间的相关性 （p = 0.2588）（图3B）。研究使用覆盖289个基因的NanoString-RNA免疫微环境panel对患者基线免疫微环境分析结果显示，M1/M2型巨噬细胞、Treg细胞以及细胞毒性细胞等免疫细胞类群在应答组和非应答组间没有显著性差异（图3C）。同时，对基线以及接受2个周期联合治疗的患者样本进行流式分选分析，结果显示应答组和非应答组间不同免疫细胞类群均没有显著性差异（图3D）。

图3. 应答组与未应答组PD-L1表达差异以及免疫细胞类群差异特征

5.  应答组患者中免疫相关基因及信号通路特征

研究根据NanoString RNA测序数据，比较了应答组与非应答组间基因表达图谱特征，结果显示应答组中免疫检查点分子LAG3、PD1（PDCD1）、PD-L1（CD274）和TIGIT以及免疫抑制性分子IDO1均显著上调（图4A）；同时，其他抗原提呈以及细胞迁移相关基因在应答组与非应答组间也有明显不同（图4B）。基因集富集分析（GSEA）表明，几个关键的免疫相关差异基因显著富集在IFN - γ应答等免疫应答相关通路上（图4C）。

图4. 应答组患者中免疫相关基因及信号通路特征

6.  构建免疫应答相关的signature及验证队列验证

研究选择富集的前三条通路包括对生物刺激的反应、对先天免疫反应的调节和T细胞迁移通路来描述免疫相关特征，选择至少在这三条通路中的两条富集的6个核心基因（PSMB10，PSMB9，LAG3，CCL5，IFI35和SH2D1A）来生成一个基因集，称为“免疫相关标签”，以区分12例试点队列中的应答组和非应答者（图5A）。同时在另外26个ICC验证队列基线样本中评估“免疫相关评分”的预测价值。结果显示高评分患者PFS与低评分患者有显著差异（9.9个月 vs. 4.1个月，p = 0.0379）以及应答组的免疫相关评分显著高于非应答组（p=0.0044）（图5B,C）。因此高免疫相关评分与患者更好预后相关。同时免疫标签响应状态的ROC显示了签名良好的区分能力（图5D），ICC患者的ROC曲线下面积为0.831（0.666–0.997）。因此本研究中6个基因生成的“免疫相关标签”具有较高的预测价值。该基因标签预测胆管癌的免疫联合化疗的预测模型已通过发明专利的申请，并受理。

图5. 构建免疫应答相关的signature及验证队列验证

讨论

本研究通过对12位接受免疫联合GemCis治疗的应答组与非应答组ICC患者进行基因突变、TMB、免疫相关基因表达谱以及PD-L1表达水平进行差异分析，结果显示应答组患者中PD-1,PD-L1, LAG3, TIGHT和IDO1等差异基因主要富集在抗原提呈、T细胞迁移和IFN - γ应答信号通路上。研究选择至少在这三种途径中的两种通路富集的6个核心基因生成了一个基因集，称为“免疫相关标签”。同时“免疫相关标签”响应状态的ROC显示了良好的区分能力。因此，预处理肿瘤活检标本中的基因表达特征可以预测晚期ICC患者免疫联合化疗疗效，该结果将有助于进一步深化BTC疗法的研究。 END 

参考文献：

[1]  Tian- mei Zeng,Yu-fei Pan et al.Immune-related RNA signature predicts outcome of PD-1 inhibitor-combined GEMCIS therapy in advanced intrahepatic cholangiocarcinoma [J].DOI:10.3389/fimmu.2022.943066

撰写丨Brynn

编辑、排版丨SX

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