作者：柴琪瑶、余珊珊、钟延昭、陆喆、邱长根、于洋、张馨文、张勇、雷泽慧、强丽华、李冰曦、逄宇、邱小波、汪静、刘翠华

第一作者及单位：柴琪瑶，中国科学院微生物研究所；余珊珊，首都医科大学附属北京胸科医院；钟延昭，中国科学院微生物研究所/中国科学院大学存济医学院

通信作者及单位：刘翠华，中国科学院微生物研究所/中国科学院大学存济医学院；汪静，中国科学院微生物研究所；邱小波，中国药科大学/北京师范大学

A bacterial phospholipid phosphatase inhibits host pyroptosis by hijacking ubiquitin

Chai Q, Yu S, Zhong Y, Lu Z, Qiu C, Yu Y, Zhang X, Zhang Y, Lei Z, Qiang L, Li B, Pang Y, Qiu X-B, Wang J, Liu CH.

Science, 2022, 378(6616): eabq0132.

doi: 10.1126/science.abq0132.

PMID: 36227980

研究背景

结核病（tuberculosis，TB）是由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）感染所引起的一种严重威胁全球人类健康的传染性疾病。2020年全球约有1000万例TB新发患者，并有150万例死于MTB感染。在感染过程中，宿主会启动多种免疫防御机制抵御并清除MTB。炎症小体（inflammasome）是宿主细胞内的一种多聚蛋白复合物，当受到活化信号刺激时，能引起下游效应蛋白gasdermin D（GSDMD）介导的炎性细胞因子（包括IL-1β和IL-18）的释放及细胞焦亡（pyroptosis）的发生。炎症小体—细胞焦亡通路在宿主抵御包括MTB在内的多种病原体感染过程中具有关键作用，然而这些病原体如何干预及逃逸该免疫机制研究尚浅。因此，进一步鉴定MTB调控宿主炎症小体—细胞焦亡通路的关键病原分子并阐明其作用机理有望为TB等感染性疾病提供新的药物靶标及干预策略。

2022 / 10 / 25

研究方法

1. 筛选体系构建：在HEK293T细胞中构建黑色素瘤缺乏因子2（absent in melanoma 2，AIM2）和NOD样受体家族蛋白3（NOD-like receptor protein 3，NLRP3）炎症小体的重组系统，通过酶联免疫吸附试验（ELISA）检测重组的HEK293T细胞分泌的IL-1β水平，以此筛选201个预测的MTB编码的真核样分泌蛋白，鉴定抑制宿主炎症小体—细胞焦亡通路的关键分子。

2. 机制探究：运用一系列遗传学、细胞生物学和生化技术，包括基因敲除、细胞感染、蛋白质免疫印迹、免疫共沉淀、免疫荧光等，确证MTB分泌的脂磷酸酶PtpB对炎症小体信号通路的抑制作用，并探究其影响炎症小体信号通路的分子机制，以及其对MTB在巨噬细胞中存活能力的影响。

3. 小鼠水平验证：利用各ptpB突变的MTB菌株，通过雾化感染的方法建立小鼠结核感染模型，通过HE染色、抗酸染色、免疫组化染色、细菌载量计数等方法观察不同时间点小鼠肺、肝脏等组织的病理情况及细菌存活情况；通过对肺及脾脏的ELISA及定量PCR（qPCR）等方法测定炎性细胞因子水平，分析小鼠的炎症免疫应答情况。

2022 / 10 /25

研究结果

1. PtpB抑制GSDMD介导的细胞因子释放和细胞焦亡：在201个预测的MTB分泌的真核样蛋白中，6个MTB蛋白（Rv0153c、Rv0561c、Rv0824c、Rv0861c、Rv1515c和Rv1679）对AIM2和NLRP3炎症小体途径均表现出明显的抑制作用。在这些蛋白中，PtpB（即Rv0153c）是被MTB分泌到宿主胞质中最显著的蛋白。因此，研究人员针对PtpB进行深入研究，并进一步通过ELISA和蛋白质免疫印迹分析证实其对AIM2和NLRP3炎症小体介导的IL-1β分泌的抑制作用。进一步实验发现， ptpB缺失（ΔptpB）导致对照组（Gsdmd+/+）而非Gsdmd 缺失组（Gsdmd-/-）的小鼠髓来源巨噬细胞（BMDMs）分泌的IL-1β、caspase-1（p20）和GSDMD-C水平及细胞焦亡比例上升。ptpB缺失还降低了Gsdmd+/+ BMDMs中的K+水平，并诱导更高比例的Gsdmd+/+ BMDMs发生肿胀（细胞焦亡的标志）；在Gsdmd-/- BMDMs中则没有这些现象。同时，MTB ΔptpB在Gsdmd+/+ BMDMs中表现出明显的胞内存活能力下降，而在Gsdmd-/- BMDMs中存活能力下降相对较小。综上，PtpB可抑制GSDMD依赖的炎症小体细胞因子释放和细胞焦亡，进而促进MTB胞内存活。具体见图1。

图1  PtpB抑制GSDMD依赖的炎性细胞因子释放和细胞焦亡。A：AIM2和NLRP3炎症小体信号通路的MTB抑制因子筛选示意图。B：代表性筛选结果。C：BMDMs细胞裂解液及培养上清中炎症小体通路相关蛋白的检测。D：钾离子指示探针检测BMDMs中的K+浓度。箭头指示焦亡细胞。标尺，10 mm。E：BMDMs膜完整性分析。箭头指示碘化丙啶（PI）阳性的细胞。标尺，10 mm。F和G：ELISA检测BMDMs上清中的IL-1β（F）和IL-18（G）水平。H：MTB在BMDMs中的胞内存活分析。I：各MTB菌株的体外生长曲线

2. PtpB破坏GSDMD-N的膜定位：在Gsdmd-/- iBMDMs中，MTB ΔptpB与野生型（WT）或ptpB回补（ΔptpB:ptpB）菌株相比，没有明显的表型差异；而当用WT hGSDMD而非hGSDMD 4A突变体（GSDMD的功能缺失突变）回补Gsdmd-/- iBMDMs时则可恢复MTB ΔptpB的表型差异。此外，PtpB的表达明显降低了外源GSDMD-N在HeLa细胞中的膜定位及其对HeLa细胞的毒性。在MTB感染期间，ptpB的缺失明显增加了GSDMD-N向巨噬细胞质膜（PM）的易位。在PM组分中也检测到由WT MTB和MTB ΔptpB:ptpB分泌的PtpB。因此，PtpB可破坏GSDMD-N的膜定位，并抑制巨噬细胞细胞因子释放和细胞焦亡。具体见图2。

图2  PtpB破坏GSDMD-N的膜定位。A：在Gsdmd−/− iBMDMs中回补表达WT hGSDMD或hGSDMD 4A突变体。B和C：ELISA检测iBMDMs上清中IL-1β（B）和IL-18（C）的水平。D和E：iBMDMs中细胞毒性（D）和细菌胞内存活（E）分析。F：GSDMD-N和GFP或PtpB-GFP共转染Hela细胞的免疫荧光分析。细胞质膜（PM）用小麦菌凝集素（wheat germ agglutinin，WGA）染色。标尺，5 μm。G和H：Hela细胞中PM GSDMD-N的定量（G）和细胞毒性分析（H）。I：BMDMs的各细胞组分中所示蛋白的含量分析

3. PtpB破坏GSDMD-N膜定位依赖其脂磷酸酶活性：MTB PtpB是一种真核样磷酸酶，研究人员构建了其突变体C160S和K164A。前者导致PtpB磷酸酪氨酸磷酸酶和磷酸肌醇磷酸酶活性同时丧失，后者仅导致PtpB磷酸酪氨酸磷酸酶活性丧失。与GSDMD-N的膜脂结合特异性相似，PtpB对PI4P的亲和力最强，其次是PI (4,5) P2，而其对硫苷脂和心磷脂的亲和力要弱得多。当与含有磷脂酰胆碱作为骨架脂质的脂质体一起孵育时，PtpB能够被含有20% PI4P或PI (4,5) P2的脂质体沉淀。与MTB ΔptpB表型相似，PtpB C160S而非K164A突变增加了MTB感染期间GSDMD-N向巨噬细胞PM的易位。同时，PtpB C160S而非K164A突变促进MTB感染的巨噬细胞分泌IL-1β和IL-18，并提升其细胞毒性，且降低了MTB胞内存活率。这些结果表明，PtpB是一种膜脂结合蛋白，其Cys160依赖的脂磷酸酶活性对于抑制GSDMD-N膜定位至关重要。具体见图3。

图3  PtpB破坏GSDMD-N膜定位依赖其脂磷酸酶活性。A和B：BMDMs中PtpB和PtpA的亚细胞定位分析。PM用WGA染色。标尺，5 μm。C：PtpB的膜脂结合试验。DAG，甘油二酯；PA，磷脂酸；PS，磷脂酰丝氨酸；PE，磷脂酰乙醇胺；PC，磷脂酰胆碱；PG，磷脂酰甘油。D：无脂质体的上清液和脂质体沉淀中PtpB的富集分析。E：BMDMs的各细胞组分中所示蛋白的含量分析。F和G：BMDMs中GSDMD-N的PM定位情况。标尺，5 μm。H和I：ELISA检测BMDMs上清中的IL-1β（H）和IL-18（I）水平。J和K：BMDMs的细胞毒性（J）和细菌胞内存活分析（K）

4. PtpB降低细胞质膜中PI4P和PI (4,5) P2的水平进而抑制GSDMD介导的宿主免疫：外源性PI4P处理WT MTB或MTB ΔptpB:ptpB感染的巨噬细胞可促进其IL-1β和IL-18分泌，增加细胞毒性并降低细菌的胞内存活率，达到与MTB ΔptpB及MTB ΔptpB:ptpB C160S突变株相似的水平。同时，PI (4,5) P2处理而非PI3P或PI (3,5) P2处理则部分减少了4个感染组之间的差异。感染MTB后，PtpB明显降低了PM中PI4P和PI (4,5) P2的水平，而对内膜（IM）中来源于细胞器的PI4P和PI (4,5) P2水平的影响要小得多。因此，PtpB可能通过消耗宿主PM上的PI4P和PI (4,5) P2抑制GSDMD介导的免疫反应。进一步采取雷帕霉素（rapamycin）诱导型磷酸肌醇去除法，以特异性去除PM上的PI4P和（或）PI (4,5) P2，发现PM PI4P和PI (4,5) P2的消耗明显降低了WT MTB和MTB ΔptpB:ptpB C160S感染组之间的IL-1β和IL-18释放、细胞毒性和巨噬细胞中细菌存活的差异。以上结果表明，PtpB降低了PM上PI4P和PI (4,5) P2的水平并抑制了GSDMD介导的免疫反应。具体见图4。

图4  PtpB降低PM PI4P和PI (4,5) P2的水平进而抑制GSDMD介导的宿主免疫。A和B：ELISA检测BMDMs上清中的IL-1β（A）和IL-18（B）水平。C和D：BMDMs中细胞毒性（C）和细菌胞内存活（D）分析。E和F：ELISA检测IM和PM中PI4P（E）和PI (4,5) P2（F）水平。G：雷帕霉素诱导去除PM PI4P和PI (4,5) P2示意图。H-J：BMDMs的PM PI4P和PI (4,5) P2水平分析。标尺，10 μm。K和L：ELISA检测BMDMs上清中的IL-1β（A）和IL-18（B）水平。M和N：BMDMs中细胞毒性（M）和细菌胞内存活分析（N）

5. PtpB通过与泛素（ubiquitin，Ub）结合抑制GSDMD介导的宿主免疫：结构生物学分析提示PtpB具有一个真核样的泛素相互作用基序（Ub-interacting motif，UIM），其疏水表面上的3个关键氨基酸位点（Ala240-Ala242）可能与Ub疏水平面上的Ile44存在相互作用。研究人员讲Ala240-Ala242突变为Glu，获得PtpB 3E突变体，以此破坏PtpB与Ub的相互作用界面。细胞内和细胞外实验证明，PtpB能够直接与Ub结合，而PtpB 3E或Ub I44A突变则可破坏他们之间的相互作用。进一步发现，Ub可提高WT PtpB对PI4P的催化效率。在感染期间，PtpB 3E明显增加了巨噬细胞质膜上的PI4P、PI (4,5) P2和GSDMD-N。进一步实验发现，在Gsdmd+/+ BMDM中，与WT MTB和MTB ΔptpB:ptpB菌株相比，MTB ΔptpB:ptpB 3E可增加IL-1β和IL-18的分泌，增加细胞毒性，降低细胞内活力；在Gsdmd-/- BMDM中则无此现象。综上，在MTB感染期间，PtpB可通过结合Ub增强其自身活性，进而破坏GSDMD介导的巨噬细胞免疫反应。具体见图5。

图5  PtpB依赖与泛素的结合抑制GSDMD介导的宿主免疫。A：PtpB和Ub的互作界面示意图。B：PtpB和Ub的相互作用分析。C：PtpB的PI4P磷酸酶活性分析。D和E：免疫荧光分析BMDMs质膜上的PI4P、PI (4,5) P2和GSDMD-N含量。标尺，5 μm。F：BMDMs的各细胞组分中所示蛋白的含量分析。G：PtpB和其突变体的磷酸酶活性检测。H和I：ELISA检测BMDMs上清中的IL-1β（H）和IL-18（I）水平。J和K：BMDMs中细胞毒性（J）和细菌胞内存活分析（K）

6. MTB依赖PtpB-泛素互作逃逸GSDMD介导的宿主免疫反应：在MTB感染的Gsdmd+/+小鼠模型中，ptpB的缺失或突变（C160S或3E）明显减少了MTB引起的肺部及肝脏炎症浸润。而在Gsdmd-/-小鼠中，各MTB菌株感染后的小鼠肺组织则表现出弥散的细胞浸润，而非典型的肉芽肿样病变，说明炎症小体通路的激活可能与炎症相关细胞因子介导的肉芽肿形成有关。同时，ptpB的缺失或突变导致感染第3周的Gsdmd+/+小鼠支气管肺泡灌洗液中的IL-1β和IL-18水平升高，以及小鼠BALF和肺组织中的γ-干扰素（IFN-γ）水平升高。有趣的是，由ptpB缺失或突变引起的Gsdmd+/+小鼠中这些炎性细胞因子的数量在感染第12周略有下降，而WT或回补菌株诱导的炎症细胞因子在感染第12周则明显增加。小鼠Gsdmd缺失则消除了这种细胞因子水平的差异。通过TUNEL染色的方法也证实，PtpB可抑制宿主GSDMD介导的细胞焦亡和抗菌免疫。因此，MTB利用脂磷酸酶PtpB结合宿主的Ub以激活其脂磷酸酶活性，进而逃逸宿主GSDMD介导的免疫反应。具体见图6。

图6  MTB依赖PtpB-泛素相互作用逃逸GSDMD介导的宿主免疫反应。A：感染各MTB菌株0～12周的Gsdmd+/+和Gsdmd-/-小鼠肺组织病理学分析。标尺，200 μm。B：小鼠肺组织的炎症水平分析。C和D：小鼠肺（C）和脾脏（D）的菌落形成单位（CFU）分析。E：ELISA检测小鼠支气管肺泡灌洗液（上）或肺组织（下）中的IL-1β、IL-18和IFN-γ。F：感染第3周的Gsdmd+/+和Gsdmd-/-小鼠肺组织TUNEL染色。标尺，100 μm。G：TUNEL染色的阳性细胞统计

2022 / 10 / 25

研究结论

在结核感染过程中，MTB利用其分泌的脂磷酸酶PtpB挟持宿主泛素重塑宿主细胞的膜脂组成，进而抑制GSDMD介导的细胞焦亡并拮抗宿主的免疫防御反应。本研究揭示了MTB逃逸固有免疫的新机制，并提供了基于病原-宿主互作界面的TB治疗新思路和潜在新靶标。

2022 / 10 / 25

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供稿：刘翠华

编辑：孟    莉

审校：范永德

发布时间：2022-10-25

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