今天推荐的思路是2021年1月14日中山大学附属第一医院精准医学研究所转化医学中心发表在 Frontiers in Cell and Developmental Biology上题为“Deficiency of Mettl3 in Bladder Cancer Stem Cells Inhibits Bladder Cancer Progression and Angiogenesis”的文章，即Mettl3在膀胱癌干细胞中的缺陷抑制膀胱癌的进展和血管生成。

RNA m6A甲基化是转录后调控的关键步骤，参与调控基因表达。由 Mettl3 催化的 m6A 修饰已被广泛认为是各种癌细胞（包括膀胱癌）中致瘤特性的关键表观遗传调控过程。然而，Mettl3 在膀胱癌中的体内功能仍然未知。作者发现激活 TEK-VEGF-A 介导的肿瘤进展和血管生成需要 Mettl3 介导的 m6A 修饰，研究结果可能为靶向 Mettl3 的膀胱癌治疗提供理论依据。

为了探索 Mettl3 在膀胱癌 BCa发生和发展中的作用，作者首先将 Upk3a^CreER 小鼠与 Mettl3^flox/flox 小鼠杂交以产生 Upk3a^CreER;Mettl3^flox/flox 小鼠，允许条件性敲除小鼠膀胱的伞状细胞、中间细胞和基底细胞中 Mettl3 的表达。Upk3a^CreER;Mettl3^flox/flox 和对照用 BBN 处理 16 周，处死小鼠以收集膀胱，膀胱肿瘤的测量表明，与野生型组的比较， Upk3a^CreER;Mettl3^flox/flox 小鼠的体积显着减少。进一步评估了 Mettl3 条件性敲除对体内肿瘤重量的影响，发现肿瘤重量有明显降低的趋势。从 H&E 染色标本观察表明，小鼠在用 BBN 治疗后膀胱尿路上皮出现病变，而 Upk3a^CreER; Mettl3^flox/flox 小鼠携带的肿瘤比 Upk3a^CreER;Mettl3^wt/wt小鼠的恶性程度低。 BCa 分级结果表明在野生型小鼠中发展为高级别肿瘤的可能性更高。通过随机双盲 IHC 评分在 Upk3a^CreER;Mettl3^flox/flox小鼠中检测到 Mettl3 和 Ki67 的表达降低以及 Caspase-3 水平的增加，表现出 Mettl3 在体内促进增殖和抑制细胞凋亡的作用。通过 Upk3a⁺ BCa 细胞中 Mettl3 的缺失，观察到 AKT1（一种增殖相关因子）和 BCL9L（一种细胞凋亡抑制剂）的显着减少。这些结果表明 Mettl3 对于 BBN 诱导的 BCa 中的细胞增殖和存活是必不可少的。

作者接下来通过生成 BBN 诱导的 K14^CreER,Mettl3^flox/flox 和 K14^CreER,Mettl3^wt/wt小鼠研究 Mettl3 在 K14⁺ CSC 中的功能。在 K14⁺ CSC 中诱导性敲除 Mettl3 后，膀胱肿瘤大小明显减小，肿瘤重量显着降低。用 H&E染色，与K14^CreER,Mettl3^flox/flox 小鼠相比，野生型小鼠的细胞和组织的异型性更显着，表明 K14⁺ CSC 中 Mettl3 的敲除抑制了 BCa 的恶性转化。免疫荧光染色数据显示，在 K14 衍生的 BCa 细胞中用他莫昔芬处理后，Mettl3 大部分被敲除，然后抑制 Ki67 和增强细胞凋亡，证明 Mettl3 对提高细胞增殖潜力和限制细胞凋亡的作用。然而，Mettl3 的缺乏导致 AKT1 的减少，同时它增加了 BCL9L 的水平。这些数据表明 K14⁺ CSC 中 Mettl3 的条件性敲除降低了 BBN 诱导小鼠的肿瘤侵袭性。

作者又使用 Upk3a^CreER 或 K14^CreER 在尿路上皮或 K14⁺ CSC 中构建了可诱导条件性过表达 Mettl3 (Mettl3KI) 的小鼠模型。比较 Upk3a^CreER 野生型和 KI 小鼠的肿瘤体积，携带 BCa 的小鼠在 Upk3a 衍生细胞中过表达 Mettl3 的肿瘤恶性程度更高。通过测量小鼠的肿瘤重量，Upk3a 来源的细胞中过量的 Mettl3 有助于促进肿瘤生长。同样，K14⁺ CSCs 细胞中 Mettl3 的过表达加速了肿瘤的生长和进展。然后，作者分别评估了 K14^CreER 野生型和 Mettl3 KI 小鼠中 SOX2（BCa 干细胞标志物）的水平，在过表达 Mettl3 后观察到 SOX2 的表达显着升高。进行 IHC 以确认 Mettl3 的敲入效率，并且在过表达 Mettl3 后，Ki67 阳性细胞增加，染色强度增强。通过 IHC 评分发现 Upk3a^CreER KI 小鼠的 Mettl3 和 Ki67 水平升高。随后，还发现 Ki67 在 K14^CreER,Mettl3 敲入小鼠中上调。数据表明膀胱尿路上皮细胞或 K14⁺ CSC 中过表达的 Mettl3 会增加小鼠 BCa 模型中的肿瘤侵袭性。

为了确定 Mettl3 如何调节 BCa 进展的下游机制，进行了 RNA 测序以研究 Mettl3 在对照组小鼠和 Upk3a/K14^CreER;Mettl3 cKO^flox/flox小鼠中调节下游靶标的机制；差异表达的基因通过使用火山散点图分为下调、不显着和上调。富集分析表明，差异基因在调节血管生成、阿米巴型细胞迁移、脉管系统发育和内皮细胞增殖方面富集，这可能涉及构建肿瘤微环境和维持肿瘤转移。接下来，作者对 down DEG 进行了 KEGG 富集分析，发现 PI3K-Akt 信号通路是 13 条通路中最富集的。此外，一些代表性的致癌特征，如 PI3K 信号传导、上皮-间质转化和血管生成在 Mettl3 条件性敲除 (KO) 小鼠中统计丰富，阐明 Mettl3 可能在肿瘤发生、转移和肿瘤血管生成介导的化学抗性方面调节 BCa。为了进一步检验这一假设，应用靶向 Mettl3 的 shRNA 在体外抑制 Mettl3 表达。与体内结果一致，T24 或 UMUC-3 细胞中 Mettl3 的下调可以抑制 PI3K/AKT 通路的参与者TEK 和 VEGF-A 的转录和蛋白含量。

为了研究 Mettl3 介导的对直接靶标的 m6A 修饰是否能有效影响 BCa 的生物过程，作者进行了甲基化 meRIP-seq 以鉴定 Mettl3 在 BCa 中的作用。首先，通路分析显示癌症通路明显富集，证明了 Mettl3 在调节 BCa 进展方面的巨大潜力。对 m6A 富集的基因集的 GO 分析表明，Mettl3 介导的甲基化可能参与转录调控、蛋白质、磷酸化和血管生成。然后，利用Integrative Genomics View (IGV) 软件根据 meRIP-seq 数据集搜索可能的目标，发现在负责肿瘤血管生成的 TEK 和 VEGF-A 基因上 m6A 峰丰富。此外，为了研究靶基因可能的 m6A 修饰位点，使用 HeLa 细胞系分析了具有 Mettl3 PAR CLIP 和 m6A CLIP 的在线数据库，并确定了特定的修饰碱基位点。结果显示，最丰富的基序“GGAC”在相应 mRNA 的特定区域中。

为了全面了解 Mettl3 介导膀胱肿瘤血管生成的内部调节机制，作者利用免疫染色来检测和定位体内血管生成相关因子。CD31 和 CD34 是内皮细胞和血管相关组织的主要指标，作者探索了它们在 BCa 切片中的表达模式。在尿路上皮中敲除 Mettl3 的 BCa 表现出明显的血管生成抑制。K14^CreER、Mettl3^flox/flox BCa 组织的血管生成能力显着下降。接下来，探究 Mettl3 的缺失是否能够抑制参与肿瘤血管生成的特定靶标（如 TEK 和 VEGF-A）的表达。用于评估下游靶标的 IHC 染色表明，Upk3a 来源的 BCa 细胞中 Mettl3 的诱导性敲除显着下调了 TEK 和 VEGF-A。巧合的是，在从 K14^CreER WT 和 KO 小鼠收集的肿瘤切片中也可以观察到这些现象。使用 RT-qPCR 检测 TEK 和 CD34 的 mRNA 水平时也显示 了一致的结果。 Upk3a^CreER,Mettl3 KO 小鼠中 TEK 和 VEGF-A 的相对 mRNA 表达与 Upk3a^CreER,Mettl3^wt/wt 相比显着降低。此外，K14 衍生的 BCa 细胞中 Mettl3 的敲除显着降低了 VEGF-A 水平。这些数据证明 Mettl3 对肿瘤血管生成发挥了作用，Mettl3 通过调节新血管形成作为 BCa 进展的合作者角色。