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Winter

作者：朱芮、尚园园、陈素婷、肖华、任汝彦、王芬、薛毅、李磊、李永国、初乃惠、黄海荣

第一作者及单位：朱芮、尚园园和陈素婷：北京胸科医院结核一科/北京胸科医院国家结核病临床实验室

通信作者及单位：初乃惠和黄海荣：北京胸科医院结核一科/北京胸科医院国家结核病临床实验室

In Vitro Activity of the Sudapyridine (WX-081) against Non-tuberculous Mycobacteria Isolated in Beijing, China

Zhu R, Shang Y, Chen S, Xiao H, Ren R, Wang F, Xue Y, Li L, Li Y, Chu N, Huang H.

Microbiol Spectr, 2022 Oct 17: e0137222.

doi: 10.1128/spectrum.01372-22.

PMID: 36250885. 

研究背景

全球非结核分枝杆菌（non-tuberculous mycobacteria，NTM）病例的迅速增加使NTM病成为一个严重的公共卫生问题。在高流行地区，NTM分离数可占分枝杆菌分离总数的30%～50%。目前已有超过200个NTM菌种或亚种被报道。较为常见的NTM肺病通常是由鸟分枝杆菌复合体（Mycobacterium avium complex，MAC）、堪萨斯分枝杆菌和脓肿分枝杆菌感染引起。因为不同的NTM菌种对大多数抗生素的自然耐药性，NTM病的治疗通常具有挑战性。因此，开发高活性的抗NTM药物是建立有效治疗方案的基础。某些用于耐多药结核病（multidrug-resistant tuberculosis，MDR-TB）治疗的新药也可能对NTM具有很强的抗菌活性。贝达喹啉（Bedaquiline，Bdq）是一种被推荐用于耐药结核病治疗的新型抗生素，它可通过抑制ATP合成来靶向结核分枝杆菌。2019年，世界卫生组织（World Health Organization ，WHO）将Bdq列为MDR-TB标准治疗方案的核心药物。Bdq在体外和体内对MDR-TB均表现出很强的抗菌活性，在体外对多种NTM表现出较强的活性。但Bdq的使用可能引起某些严重的药物不良反应，如不明原因的死亡和QT间期延长。一项对1303例患者进行的meta分析显示，在临床使用中，QT间期延长的发生率为10.6%，有0.9%的患者因QT间期延长而停止服用Bdq。舒达吡啶（WX-081）是一种新的抗结核候选药物，它在Bdq的结构基础上进行了优化。基于动物模型的体外和体内试验的研究表明，与Bdq相比，WX-081对结核病具有相当的疗效，但具有较低的心脏毒性和更有利的药代动力学特性。因此，WX-081被认为是一种很有前途的抗结核候选药物，目前正在中国进行二期临床试验研究。为了更好地了解WX-081对NTM的抗菌活性，我们对最常见的几种NTM临床分离株进行了体外抑制和细胞内杀菌活性的评估，并分析了其细胞毒性。旨在阐明WX-081对临床常见的NTM分离菌株的抗菌性，评估其用于NTM病治疗的潜力。

研究方法

一、标准菌株和临床分离菌株

对北京胸科医院（中国北京）生物样本库中保存的50株分枝杆菌标准株进行检测，其中有26株快生长分枝杆菌（rapidly growing mycobacterium，RGM）和24株慢生长分枝杆菌（slowly growing mycobacterium，SGM）。这些标准菌株的种的组成见表1、2。通过在含对硝基苯甲酸培养基上的生长试验和16S rRNA、hsp65、rpoB、16-23S rRNA转录间隔区的序列比对，将132株NTM临床分离株鉴定到菌种或亚种水平。包括40株脓肿分枝杆菌、29株胞内分枝杆菌、21株鸟分枝杆菌和42株堪萨斯分枝杆菌。

二、最低抑菌浓度（MIC）实验

Bdq和WX-081两种药物均溶解于二甲亚砜中。无菌条件下，制备8 mg/ml药物储液。微量肉汤稀释法按照临床和实验室标准研究所（CLSI）指南进行。SGM采用富含5%OADC的MH培养基，RGM采用不含OADC的MH培养基。微量肉汤稀释倍数为2倍，Bdq和WX-081的浓度范围为0.0039～2.0 μg/ml。将每株菌株制备成浊度为0.5麦氏的菌液，按照1：200的比例将菌液接种到微孔板中。然后，在37 °C下孵育3 d（RGM）或7～10 d（SGM）。每孔加入含有20 μl alamarBlue和50 μl 5%吐温80的混合溶液，在37 °C下孵育24 h，然后进行结果判读，MIC值被定义为颜色从蓝色到粉红色变化的抗生素最低药物浓度。

三、野生型界值（ECOFF值）的确定

根据MIC值的分布曲线确定ECOFF值，ECOFF值定义为单峰MIC分布中抑制95%的临床菌株生长所对应的药物浓度。

四、最大杀菌浓度（MBC）值的确定

在与抗生素孵育3 d或7 d后，通过CFU计数法测定96孔板中5株NTM参考菌株的MBC。根据CLSI指南，MBC由最终接种量的99.9%杀死量来测定。Bdq和WX-081的浓度范围均为1×MIC～128×MIC。RGM孵育3 d，SGM孵育7～10 d。每孔100 μl的培养等分放置在含或不含5%OADC的CAMHB上进行培养。RGM在7～10 d或SGM在28 d后计数CFU。根据CLSI指南，MBC被定义为CFU中最低的有效药物浓度，至少比初始CFU低3 log10。当MBC/MIC比值＞4时，抗生素被认为具有杀菌活性；否则，具备抑菌活性。

五、细胞毒性试验

使用人单核细胞白血病细胞系（THP-1细胞）检测Bdq和WX-081的毒性，将细胞接种到96孔板中，用100 nM 丙二醇甲醚醋酸酯（PMA）诱导分化为巨噬细胞。48 h后，细胞清洗一次，在含有10%胎牛血清（RPMI完全培养基）的新鲜RPMI培养基中培养。分别加入药物浓度1~16 μg/ml，再孵育24 h和48 h。

使用CCK-8细胞增殖和细胞毒性检测试剂盒检测不同浓度的Bdq和WX-081的细胞毒性。使用Multiskan Go酶标仪（美国赛默飞世尔科技公司）测定450 nm下的吸光度值（Abs）。

六、统计学处理

采用SPSS 23.0软件和GraphPad Prism 7.0软件进行数据的统计分析。采用Spearman检验分析临床中Bdq MIC值与WX-081 MIC值之间的相关性。

研究结果

一、Bdq和WX-081对NTM标准株的MIC值

Bdq和WX- 081对50株标准株的MIC值见表1、2。对于同一标准菌株，WX-081的抗菌活性与Bdq相似，具有相同的MIC或1～2倍差异（表1）。与Bdq一样，WX-081对几乎所有的SGM物种均表现出较强的抑菌活性，其MIC均低于0.25 μg/ml。只有两种SGM，即M. rhodesia and M. celatum的MIC＞2 μg/ml。此外，WX-081对所有的RGM标准菌株表现出很强的体外抑菌活性；26种RGM的MIC均≤0.5 μg/ml，23种RGM的MIC均≤0.25 μg/ml。

二、Bdq和WX-081抑制不同NTM临床分离株生长的MIC分布和流行病学临界值

4种最常见的NTM菌种对Bdq和WX-081的MIC分布如图1所示。临床分离株对Bdq和WX-081的敏感性与标准菌株一致，即对绝大多数SGM分离株均具有较强的抑菌活性。对脓肿分枝杆菌也有类似的活性，但其MIC值相对高于SGM。

图1 Bdq和WX-081对4种最流行的NTM菌种的MIC分布。A：脓肿分枝杆菌的Bdq MIC分布，B：脓肿分枝杆菌的WX-081 MIC分布。C：堪萨斯分枝杆菌的Bdq MIC分布，D：堪萨斯分枝杆菌的WX-081的MIC分布。E：鸟分枝杆菌的Bdq MIC分布，F：鸟分枝杆菌的WX-081 MIC分布。G：胞内分枝杆菌的Bdq MIC分布，H：胞内分枝杆菌的WX-081的MIC分布。浅灰色的点表示当MIC值变化时应变的累积频率。条形图表示与MIC值对应的频数。

Bdq和WX-081对堪萨斯分枝杆菌和胞内分枝杆菌的抑菌活性最强，流行病学临界值（ECOFF）为0.0156 μg/ml，MIC50为0.0078 μg/ml，MIC90为0.0156 μg/ml。对于这两个菌种，本研究中使用的大多数菌株的MIC值低于0.008 μg/ml。Bdq和WX- 081对鸟分枝杆菌的活性弱于胞内分枝杆菌，ECOFF分别为0.0625 μg/ml和0.125 μg/ml。WX-081对鸟分枝杆菌的抑制能力略弱于Bdq。Bdq和WX-081对鸟分枝杆菌的MIC50和MIC90分别为0.03125 μg/ml和0.0625 μg/ml、0.0625 μg/ml和0.125 μg/ml。Bdq和WX-081对脓肿分枝杆菌具有良好的抑制活性，MIC50分别为0.125 μg/ml 和0.25 μg/ml。Bdq和WX-081对脓肿分枝杆菌的MIC90分别为0.25 μg/ml和0.5 μg/ml。Bdq和WX-081对脓肿分枝杆菌的ECOFF分别为0.25 μg/ml和0.5 μg/ml。

无论是RGM还是SGM，Bdq和WX-081对其的MIC值均具有较强相关性（图2）。其中，Bdq和WX-081对脓肿分枝杆菌的MIC值相关性良好（Spearman‘s q=0.722，P =0.0000），对堪萨斯的MIC也存在显著相关性（Spearman’s q = 1.000，P = 0.0000），对鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌的MIC值之间相关性也很强(Spearman’s q = 0.967，P = 0.0000; Spearman’s q = 0.784，P = 0.0000)。

图2  A：Bdq和WX-081对脓肿分枝杆菌MIC值之间的相关性。B：Bdq和WX-081对堪萨斯分枝杆菌MIC值之间的相关性。C：Bdq和WX-081对鸟分枝杆菌MIC值之间的相关性。D：Bdq和WX-081对胞内分枝杆菌MIC值之间的相关性

三、最低杀菌浓度的测定

WX-081和Bdq对5株NTM标准菌株的最低杀菌浓度（MBC）均＞32×MIC。WX-081或Bdq与5株参考菌株的MBC/MIC比值远高于4，表明两种药物对脓肿分枝杆菌、偶然分枝杆菌、胞内分枝杆菌、鸟分枝杆菌和堪萨斯分枝杆菌均具有抑菌活性（表3）。

四、 Bdq和WX-081对THP-1细胞的细胞毒性

药物孵育24 h后，16 μg/ml时THP-1细胞活力＞75%，8 μg/ml 时THP-1细胞活力超过90%，4 μg/ml时浓度达100%。16 μg/ml 药物孵育48 h时，细胞活力下降至75%以下，8 μg/ml 药物孵育48 h时，细胞活力达到75%以上。然而，与药物孵育48 h后，仅在1 μg/ml 时细胞活力达到100%。虽然WX-081的细胞活力低于Bdq，但Bdq与WX-081之间的差异无统计学意义（图3）。

图3 Bdq和WX-081对THP-1细胞的细胞毒性。用不同浓度的Bdq和WX-081处理THP-1细胞24 h (A)和48 h (B).

研究结论

WX-081对不同NTM具有较强的抗菌活性，细胞毒性低，因此可能被认为是一种有应用潜力的NTM病治疗候选药物。

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供稿：尚园园

编辑：孟    莉

审校：范永德

发布日期：2022-11-07

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