2023-07-18
细胞增殖（Proliferation）是生物体的重要生命特征。今天，小编为大家介绍一种可以测定细胞增殖能力实验——克隆形成实验。
细胞克隆形成实验是用来检测细胞增殖能力、侵袭性、对杀伤因素敏感性等的重要技术方法。
克隆形成能力简而言之就是单个细胞形成50个细胞数以上克隆的能力。
注：克隆就是当单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体。每个克隆含有50以上的细胞，大小在0.3-1.0 mm之间。
由于细胞生物学性状不同，克隆形成能力差别也很大。一般正常细胞克隆形成能力弱，肿瘤细胞克隆形成能力强。此外，各种理化因素可能导致细胞的克隆形成能力发生改变。
克隆形成率可以反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状，是体外测定细胞增殖能力的一种常用技术。计算公式：克隆形成率=克隆形成数/接种细胞数。
■ 通过对细胞处理后在培养板上的克隆形成能力来提示处理后细胞的增殖能力；
■ 评价不同杀伤因素(药物、基因等)对肿瘤细胞增殖能力或群体依赖性的敏感性;
克隆形成依据采用的培养介质的不同，分为平板克隆和软琼脂克隆两类。
（1）. 平板克隆形成（Colony formation）：细胞培养在培养基中，应用于贴壁的细胞。
（2）. 软琼脂克隆形成（soft agar colony formation）：细胞被琼脂糖挂起来，主要应用于悬浮的肿瘤细胞和转化细胞系。
下面我们就具体看一下这2种实验技术的具体操作。
如果做药物处理，则在培养基中加入药物。
原理：将细胞分离成单细胞悬液，在培养皿中接种培养，根据集落形成数量和大小来检测细胞增殖能力和致瘤性。
实验步骤
①取对数生长期的单层培养细胞，用0.25% 胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞后，重悬于含10%胎牛血清的完全培养基中，并计数；
②接种：于6孔板培养板中各实验组接种400-1000个细胞/孔（根据细胞生长情况确定，一般为700个细胞/孔），补加室温预热的完全培养基（含10%胎牛血清)至4mL，轻轻摇匀。
Ps：
■ 接种时细胞密度适度，不可过高。细胞接种密度与最终实验结果密切相关，若细胞太多，形成克隆数目太多，处理结果时数克隆不仅容易出错，而且图片很难看。细胞太少，不能形成克隆。因此，为了获得美观的图片和准确的数据，第一次实验最好设置细胞接种梯度，如500-1000-2000-5000个/孔挑选出最合适的接种密度。
③于细胞培养箱中培养7-14天左右（当出现肉眼可见的克隆时，终止培养）；
Ps：
■ 培养时间的确定：通常情况下，单个细胞在体外增殖6代以上所组成的细胞群称为一个阳性克隆，时间约为一周；但具体时间因细胞增殖能力而已异，因此应密切关注细胞生长情况，隔天在显微镜下观察克隆情况，若单个克隆细胞数到达50个左右即可固定细胞。
■ 细胞未形成克隆的原因：并非每种细胞都可以形成克隆，克隆形成率与细胞本身增殖能力有关。还与接种细胞密度，加入培养液的体积、血清浓度有关。
若细胞克隆率过低，可在培养基中添加胰岛素、地塞米松等促克隆形成物质。
④固定染色：移除上清液，用PBS小心浸洗2次。每孔加入多聚甲醛固定细胞20min；移除多聚甲醛，PBS洗涤1次，加适量结晶紫染色10-20 minmin；用PBS洗涤细胞数次，晾干，并拍照。
Ps：
■ 结晶紫是碱性染料，可以与核酸结合把细胞核染成蓝色，便于观察及计数
■ 缓冲液清洗和固定时沿着孔板侧壁加入，不要吹掉细胞。
■ 染色前固定液要吸干净，避免局部残留固定液将染剂稀释造成染色不均一。
■ 染色完成后，务必将染液清洗干净，不要在孔中有残留。
⑤数据分析：显微镜下观察阳性克隆，即每个克隆>50个细胞，相机拍照，数克隆数（大小约在0.3-1.0 mm）计算克隆形成率，并统计克隆大小。
克隆形成率=（克隆数/接种细胞数）×100%，实验至少重复3次。例如：接种细胞为500个，克隆数为200个，则克隆形成率=(200/500)×100%=40%。
Ps：
■ 细胞计数时建议多计数几次。
■ 结晶紫染色后及时拍照并计数克隆，不能在室温放置太久，否则影响拍照效果。
■ 试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。细胞一定要分散得好，不能有细胞团，接种密度不能过大。
软琼脂克隆形成试验是一种广泛应用于体外细胞转化的技术，利用软琼脂为培养介质，使细胞在悬浮状态下生长。
在传统的软琼脂克隆形成试验中，细胞生长在上层含有细胞培养基的软琼脂中，下层软琼脂也与细胞培养基混合，但含有较高浓度的琼脂。这可以防止细胞贴附在培养板上，还可以使转化细胞形成可见的菌落。
这种技术的原理是正常细胞依靠细胞与细胞外基质的接触才能生长和分裂，相反，不管周围环境如何，转化细胞均具有生长和分化的能力，因此能够以锚定独立的方式形成菌落的细胞被认为是转化和致癌的。这种方法的总体目标是以半定量和严格的方式测定细胞的这种能力。
近年来，软琼脂克隆形成试验已被改进，以满足特定的需要，一种是掺入荧光染料，允许高通量菌落计数，另一种是使用专门的琼脂溶液，以便在需要蛋白质或DNA样本进行克隆形成后检索活细胞。
实验步骤：
①配制1.2% 和0.7%琼脂，高压灭菌后，置于水浴锅维持在42℃中使其不会凝固。
Ps：琼脂放入水浴锅中维持在42℃左右。温度过低琼脂凝固，在做基底时琼脂凝固过快会导致不均一，温度过高则会将细胞烫死。
②据实验需要的量配制20% FBS+2×基础培养基。
③铺下胶：将1.2% 琼脂与步骤②配制培养基混合（1：1），铺入6孔板作为下层胶，每孔1.5ml（加混合液时不能产生气泡），轻轻混匀，37°C孵育30 min使之凝固。
④细胞计数：取对数生长期的各组细胞，分别用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，离心，弃上清后，用培养基调整细胞浓度为40×104/mL以上，这样加的体积小于100ul，不会影响其他成分的稀释程度。
⑤铺上胶：将0.7%琼脂与步骤②配制培养基混合（1：1），再将细胞悬液加入上述混合液中，混匀后迅速加入6孔板中，每孔1ml。
Ps：
■ 上层胶细胞数目根据不同的细胞类型而定。一般以5000个细胞/孔作为起始浓度，根据需要调整。
⑥室温静置30 min，待上胶凝固后放入细胞培养箱。根据细胞的生长速度培养2-3周后显微镜下观察克隆大小，与平板克隆一样，每个克隆>50个细胞，显微镜拍照。
注：
■ 在软琼脂克隆形成实验中，需配置下层软琼脂和上层软琼脂，前者作为支撑防止细胞贴附生长，后者是作为营养补充剂以及为防止下层琼脂胶干燥。
■ 实验过程中速度要快，防止局部结块
■ 软琼脂与细胞液混合时温度不宜超过40℃，否则将会烫伤/死细胞。
■ 琼脂经灭菌后应分装备用，反复加热易导致琼脂降解而产生毒性，且其硬度也会有所下降，因此高压灭菌后应进行分装。
以上为2种细胞克隆形成的实验方法，它们的操作过程很简单。但是我们会遇到很多小问题，导致很多同学结果不理想，在最终拍照时很难拿到好看的图片，不得一次又一次重复实验。
总体而言，关于细胞克隆形成实验，控制接种密度，铺板均匀是2大关键点，大家在平时实验中，一定要多多摸索和练习。
百度浏览 来源 : 中洪博元生物
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