百令胶囊^®（Bailing capsule，BLC），一种传统中药，由冬虫夏草菌株低温发酵精制而成，主要成分含有核苷类、氨基酸类、肽类和甾醇类等化合物^[1]。但是其全成分化学模式及物质基础研究薄弱，显然不利于BLC的全面质量控制和进一步深入机制探讨。因此，亟需尽快阐明BLC的主要化学成分，明确其物质基础。

BLC在临床上广泛用于治疗甲状腺炎、糖尿病肾病、狼疮性肾炎等疾病^[2,3]。BLC无论是单独治疗还是与其他药物联合治疗，在甲状腺炎的治疗中都发挥着重要作用^[4,5]。其可能机制是通过靶向Fabp4、Acsl1、Acadl调控PPAR信号通路调节脂肪酸代谢和改善自身免疫性甲状腺炎^[6]，但其疗效的化学成分并不全面。

本研究旨在基于UHPLC-LTQ-Orbitrap-HRMS和UHPLC-QqQ-MS/MS全面表征BLC化学成分分析和主要活性成分的定量分析，同时采用网络药理学和分子对接技术，阐明BLC治疗甲状腺炎主要活性成分及潜在作用机制。

本研究样品来源为中美华东生产的百令胶囊^®，共计6批次（批号:2105016、2202060、2108026、2109010、2106302和2106005）。

采用UHPLC-LTQ-Orbitrap-HRMS对6批次BLC的58个化合物进行了鉴定，并利用UHPLC-QqQ-MS/MS同时对16个具有代表性的活性成分进行了定量分析。

以“甲状腺炎”为关键词从GeneCard (https://www.genecards.org/)、DisGeNET (https://www.disgenet.org/)、Malacards (https://www.malacards.org/pages/info/)和NCBI基因 (https://ncbi.org/)数据库中搜索相关疾病靶点。将收集到的疾病基因合并作为甲状腺炎的疾病基因集。采用网络药理学和通路分析，包括GO富集和KEGG通路分析，构建和分析“BLC活性成分-目标通路”网络，并利用分子对接技术验证网络药理学结果。

一、基于UHPLC-LTQ-Orbitrap-MS对BLC的化学成分进行定性分析

BLC正负离子模式下的总图谱见图1。共鉴定出58个化合物，分别为17个核苷、15个氨基酸、5个嘌呤类生物碱、4个嘧啶类生物碱、8个有机酸，2个核苷酸，2个糖醇和5个其他化合物。12个化合物（D-甘露醇、虫草素、酪氨酸、尿苷、精氨酸、组氨酸、肌苷、腺苷、鸟苷、5’-鸟苷酸、5-腺苷酸、L-赖氨酸）与标准品对比测定，其他化合物通过片段信息和文献比对确定。

图1 BLC UHPLC-LTQ-Orbitrap-MS的正（a）负（b）离子模式下TIC图

二、基于UHPLC-QqQ-MS/MS技术测定6批BLCs中16个主要活性成分的含量

根据文献选取BLC的16种活性化合物，包括酪氨酸、尿苷、组氨酸、肌苷、5‘-鸟苷酸、L-赖氨酸、次黄嘌呤、尿嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤、D-甘露醇、虫草素、腺苷、鸟苷、5’-腺苷酸、L-谷氨酸进行定量分析。使用UHPLC-QqQ-MS/MS技术测定了6批BLCs MRM模式下16种主要有效成分的浓度，根据标准曲线计算浓度，结果如表1所示。

表1 不同批次BLC中16种有效成分的浓度

三、基于网络药理学和通路分析探究BLC缓解甲状腺炎的分子机制

BLC缓解甲状腺炎获得的蛋白相互作用网络如图2所示，具有较高连通性的靶点包括AKT1、MAPK3、RAC1和PIK3CA。

图2 BLC缓解甲状腺炎蛋白相互作用网络

KEGG分析结果显示，富集了78条相关通路，主要包括甲状腺激素调节信号通路、Ras、PI3K/AKT和MAPK信号通路，它们与炎症免疫、激素调节等过程有关。这些经典信号通路在BLC缓解甲状腺炎中发挥重要作用，结果如图3所示。

图3 BLC缓解甲状腺炎的（a）GO分析和（b）KEGG富集通路

四、利用分子对接技术进行验证

分子对接分析证实了网络药理学的发现，表明腺苷、鸟苷和虫草素对AKT1、MAPK3、PIK3CA和RAC1具有较强的亲和力。

图4 BLC活性成分与靶点的分子对接图

(a)腺苷-AKT1, (b)腺苷-PIK3CA, (c)鸟苷-AKT1, (d)鸟苷-RAC1, (e)鸟苷- PIK3CA, (f)鸟苷-MAPK3, (g)虫草素-MAPK3

总的来说。本研究首次全面表征了BLC的化学成分轮廓，并利用网络药理学和分子对接技术初步研究了BLC治疗甲状腺炎的潜在机制。

研究表明，鸟苷、腺苷和虫草素可能是BLC的主要活性成分，靶向AKT1、MAPK3和PIK3CA，可能是BLC治疗甲状腺炎的潜在靶点。BLC可能通过Ras、PI3K/AKT和MAPK信号通路发挥治疗作用。

本研究揭示了BLC治疗甲状腺炎的有效成分及潜在的分子机制，为后续研究提供了坚实的基础。

我国甲亢及甲减的患病率均高于全球水平，分别为1.6%和17.8%^[7]。弥漫性毒性甲状腺肿（Graves’ disease，GD）和桥本甲状腺炎（Hashimoto thyroiditis，HT）分别是甲亢与甲减最常见的病因，数十年无新治疗手段，药物仅对症治疗，缺乏针对甲状腺自身免疫的调节，无法阻止病情进展。

小样本研究提示发酵冬虫夏草菌粉制剂通过调节GD和HT患者的免疫平衡，降低GD及HT患者TRAb、TPOAb、TgAb水平，调控细胞因子水平，改善甲状腺功能^[8,9]。

目前由山东省立医院牵头的两项“百令胶囊治疗桥本甲状腺炎的有效性及安全性的多中心、开放、随机、对照临床试验”（Bridge研究，ChiCTR2300072286）和“百令胶囊联合甲巯咪唑对比甲巯咪唑单药治疗弥漫性毒性甲状腺肿（Graves病）有效性及安全性的随机对照临床试验”（Brave研究，ChiCTR2300072290）正在开展，拟招募TPOAb＞300 IU/ml的HT患者和TRAb＞1.75 IU/L的GD患者，分别连续治疗6个月和12个月。

图5 Bridge&Brave研究设计

自身免疫性甲状腺疾病已严重影响人类健康，成为内分泌领域继糖尿病后的第二大疾病，目前临床治疗方法都不能从发病机制上进行干预。中西医结合可优势互补、取长补短，在自身免疫性疾病的调控和慢病的防治上具有独特优势。此次研究的开展旨在提高患者对疾病认知的同时，为临床治疗提供新的选择。

参考文献

[1] Zheng, Y. Q. (2015). Research of chemical composition and quality standard about fermentation cordyceps sinensis powder and bailing capsule[Z]. Zhejiang University of Chinese Medicine. Master, 101

[2] Li, Y., Xu, T., Qiu, X., Tian, B., Bi, C., & Yao, L. (2020). Effectiveness of bailing capsules in the treatment of lupus nephritis: A meta-analysis[J]. Molecular Medicine Reports, 22(3), 2132–2140.

[3] Li, Y. L., Cheng, F., Chen, Y., Wang, J., Xiao, Z. D., & Li, B. (2022). Effect of traditional Chinese medicine bailing capsule on renal anemia in maintenance hemodialysis patients: A protocol for systematic review and meta-analysis[J]. Medicine (Baltimore), 101(15), e29086.

[4] Liu, Y. Q., Wang, Y. F., & Guo, L. J. (2020). Efficacy of bailing capsule for autoimmune antibodies in Hashimoto thyroiditis: A meta-analysis [J].Chinese Journal of Evidence-Based Medicine., 20(04), 453–457.

[5] Wei, Z. L., & Jia, X. B. (2021). Effect of bailing capsule combined with prednisolone tablet on immune function and thyroid antibody level in patients with graves' disease[J]. Chinese and Foreign Medical Research.,19(20), 58–60.

[6] Wang Q，Xu L，Wu J，et al．(2024). Bailing capsule alleviates autoimmune thyroiditis via regulating peroxisome proliferator-activated receptor signaling pathway: a multi-omics analysis[J]．Journal of Traditional Chinese Medicine. link.cnki.net/urlid/11.2167.R.20240409.1421.002

[7] Shan Z, Chen L, Lian X, et al. (2016). Iodine Status and Prevalence of Thyroid Disorders After Introduction of Mandatory Universal Salt Iodization for 16 Years in China: A Cross-Sectional Study in 10 Cities[J]. Thyroid., 26(8):1125-30.

[8] Yang Z. (2022). Effects of Bailing capsules combined with Levothyroxine sodium in treatment autoimmune thyroiditis[J]. Medical Journal of Chinese People's Health. , 34(19):24-27.

[9] He T, Zhao R, Lu Y, et al. (2016).Dual-Directional Immunomodulatory Effects of Corbrin Capsule on Autoimmune Thyroid Diseases[J]. Evid Based Complement Alternat Med.,2016:1360386.

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