小咖有话说：不管是在讨论群里，还是私信给小咖的问题中，都有人问过这样的问题：“我的样本量为xx，这个数量很小吗？”。有位伙伴回复说：“病例对照研究中，非常经典的研究，只有8个病例，32个对照，你说少不少？多少，不能一概而论，还要取决你的问题是不是新颖，病例组是否容易获得等等”。

对这个经典研究感兴趣的一位伙伴，花了很长时间搜集资料，完成此文。接下来，让我们一起回到40多年前，看看这个改变历史的病例对照研究。

Diethylstilbestrol（DES，Stilbestrol，乙烯雌酚）是一种人工合成的非甾体雌激素物质，1938年在美国问世，最早被用于有流产或早产风险的妊娠期妇女中，作为雌激素补充剂。在40-50年代，乙烯雌酚被广泛用于全美的高危孕妇，然而在1971年，FDA发布警示公告，指出乙烯雌酚不应用于妊娠期妇女。

FDA的决定是如何做出的？我们要从同年，Dr. Herbst在麻省总医院进行的一个病例对照研究说起。

Arthur L. Herbst，1959年从哈佛大学医学院毕业，在位于波士顿的麻省总医院完成住院医培训，成为了一名妇产科医生。

图片：1972年，Dr. Herbst接受《CA-A Cancer Journal For Clinicians》采访时的封面

1966到1969年间，Dr. Herbst在波士顿文森特纪念医院（Vincent Memorial Hospital，当时承担了麻省总医院妇产科的医疗服务，现已正式合并）连续收治了7位女性阴道腺癌患者。

阴道腺癌是一种非常罕见的生殖系统癌症，只占全部生殖系统癌症的2%，大多出现在50岁以上女性中。然而，这7例患者不仅在短短4年之间连续出现，而且全部是25岁以下的年轻女性，这引起了Dr. Herbst的强烈兴趣。他把这7个病例的病理检验结果发表在1970年4月的《Cancer》杂志上。 

图片来源：Dr. Herbst在《Cancer》上用病例系列的形式发表了7例阴道腺癌的病理结果

连续出现的阴道腺癌是怎么发生的？难道是有了一种新的疾病吗？医生首先怀疑病人是否使用了某种共同的阴道刺激物，譬如某种卫生棉条，然而答案是否定的。在性行为方面，在7位病人中，只有1位曾有过性经历，并未服用过避孕药。面对着年轻而迷茫的患者，Dr. Herbst决定进行一项病例对照研究，来找出这些不寻常的阴道腺癌的致病因素。

在与病人家属的交谈中，一位母亲提到了在怀孕时曾经接受过雌激素（DES）治疗，这引起了Dr. Herbst的同事——Dr. Ulfelder的注意（Howard Ulfelder，MD，时任哈佛大学医学院妇产科麦格教授（Megis Professor））。这7例患者都出生在40年代末，50年代初期，正是雌激素疗法在高危产妇中大规模推行的时期，有没有可能是因为这个当时新推广的疗法造成的副作用呢？会不会是妊娠期的其他因素影响了产儿成年后的健康状况？

为了回答这个问题，Dr. Herbst和Dr. Ulfelder在这个经典的病例对照研究中纳入了8个阴道腺癌病例和她们的母亲：7个上文已经提到过，第8个病例（患者22岁）由Dr. Goldstein提供（Donald P. Goldstein， MD，布莱根妇女医院创始人，也是哈佛医学院的校友）。

同时，他们选择了和病例在同时间（误差不超过5天）、同医院生产的女婴以及她们的母亲，以1：4的比例选为对照，即每1例病例，匹配4个对照。

研究员利用结构化问卷的方式，调查病例组和对照组的母亲在怀孕时（特指病例这一胎，后同）的种种因素，结果如下：

Dr. Herbst指出，孕中雌激素（也就是DES）使用和女童成长期间发生阴道腺癌显著相关（P<0.00001）。所有接受雌激素治疗的母亲都从妊娠早期开始治疗。有6位母亲确定她们接受的是DES治疗，剩下的两位母亲中，一位母亲的产科医生确认了当年使用了DES，只有一位母亲怀孕期间没有接触DES。

在8个病例的母亲中，本次生产之前总共发生过10次流产，而32个对照母亲中仅仅发生6次。从上表中也可以看出，病例母亲发生孕中出血的概率也较大。这两点，很有可能是当年医生建议她们进行雌激素疗法的原因。

研究结果发表在1971年4月的《新英格兰医学杂志》上。

图片：Drs. Herbst, Ulferlder 和 Poskanzer在新英格兰杂志上发表的论文

Dr. Herbst的病例对照研究刚刚一发表，就引起了妇产科医生的强烈关注。仅仅3周之后，来自纽约州卫生部门（New York State Department of Health）的Dr. Peter Greenwald就从纽约州癌症登记处找到了另外的5个病例。

有了Dr. Herbst的成功经验，Dr. Greenwald同样设计了一个病例对照研究，深入分析了DES疗法以及剂量和产儿之后患阴道腺癌的关系。他发现，从1950到1970的20年间从纽约州癌症登记处找到的全部5例疑似病例中，4例病例的母亲在怀孕时接受了不同浓度DES治疗，剂量从怀孕初期0.1mg-5mg/d到末期100mg-125mg/d不等，剩下的1例接受了双烯雌酚（与DES类似的另一种人工合成雌激素）治疗。

这个研究不仅为Dr. Herbst提出的相关性提供了额外的证据，而且论证了不同浓度DES可能的有害性，引起学界的热烈讨论。这篇研究发表在1971年8月的《新英格兰医学杂志》上。

图片：Dr. Greenwald在《新英格兰医学杂志》上详细描述了5个阴道腺癌患者在胎儿时期接受的DES治疗及剂量

基于临床研究中得出的结论，FDA在1971年11月发布警告，根据Dr. Herbst和Dr. Greenwald在《新英格兰医学杂志》发表的研究，以及Dr. Herbst给FDA报告的额外15个病例，FDA认为基本可以确认所发现的阴道腺癌和乙烯雌酚的使用相关。针对这个问题，FDA采取了三个措施：

1. 所有生产DES以及类似物（dienestrol, hexestrol, benzestrol, promethestrol）的药厂都需要修改药物说明书，把妊娠期妇女列为药物禁用对象。

2. 所有其他的雌激素类似物都必须在药物说明书中写出“已有统计学研究指出，妊娠期DES使用与产儿多年后发生阴道腺癌显著相关，其他雌激素是否有此健康危害目前未知，在任何情况下，不建议对妊娠期女性使用雌激素”。

3. 呼吁开展大规模流行病研究，研究DES相关的阴道腺癌发病率，危险人群等等。

图片:原始的FDA通讯已经找不到了，图片是1971年11月加州医学杂志转登的FDA药物公告

图片：FDA印刷并分发给所有曾经开出DES处方的医生的信息收集表

响应FDA的号召，美国CDC在1974年启动了DES Daughters研究，研究所有在胎儿时期暴露在DES治疗中的女性，出生后面临的健康危险。之后，类似的研究也扩展至妊娠期间直接接受DES治疗的女性（ DES Mother，1980年启动），以及男性胎儿（DES Sons，1985年启动）。

图片：CDC公告，关于DES暴露在不同相关人群中的可能危害；来源：cdc.gov

从1938年面世到1971年被FDA叫停，DES及其类似物（使用各种不同的商品名）被广泛应用在全美各个妇科诊所的高危孕妇中，截至CDC 2001年的统计，DES至少影响了5百万到1千万美国人。如果不是Dr. Herbst，Ulfelder，Greenwald等人的研究成果，DES的危害可能进一步扩大，影响到更多的人。

图片：1976年，JAMA刊文，总结了所有DES药物，警示医生和患者；来源：cdc.gov

四十多年过去了，因为FDA和CDC的及时出面，DES已经不会再应用于妊娠期女性中，大部分受到DES影响的人们已经获得了妥善的治疗。当年进行的病例对照研究，也已经成为了流行病学教材中的经典案列。今天，我们不仅仅是来讲这个FDA史上的精彩故事，也来仔细看一看，到底是什么样的研究，仅仅靠8个病例，就扭转了人们对DES治疗的看法。

病例对照研究（case-control study）是观察性临床研究中常见的一种，常常用于病因的分析。病例对照的基本原理是，以确定患有某疾病的病人作为病例，以不患病但与病例具有可比性的个体作为对照，通过询问、实验室检查或复查病史、搜集研究对象既往各种可能的危险因素的暴露史，测量并比较病例组与对照组中各因素的比例，经过统计学检验，若两组差别有意义，那么我们就可以认为这个因素与疾病之间存在统计学上的关联。

上面的一段话是从课本中抄下来的，让我们翻译一下，以Dr. Herbst在1971年做的那个经典的病例对照研究为例。他把收集的全部8例阴道腺癌患者作为病例，按照1:4的比例收集了32个未患病的女性作为对照，通过问卷的方法回顾调查她们的母亲妊娠期间的吸烟、出血、DES治疗等情况，对两组进行比较，然后得出DES治疗与患阴道腺癌相关的结论。这就是一个经典的病例对照研究的设计。

在满足了研究设计的基本框架之外，大家都公认Dr. Herbst的这个研究做的好！它好在哪里呢？我认为主要在这3个方面：

1. 研究的问题很有临床意义，所以，提出一个好的临床问题非常关键！

    

2. 收集的病例很特别，也很有代表性（包括了4年内波士顿地区的全部确诊病例）；

    

3. 对照按照研究者提前定义的条件（在同时间（误差不超过5天）、同医院生产的女婴）和病例进行匹配。

前两点主要与临床问题有关，那么第三点中的这个“匹配”为什么让我们觉得研究更好了呢？

经典的病例对照研究设计中，病例和对照可以匹配，也可以不匹配。匹配，最主要的目的是保证病例和对照的可比性。因为对照和病人在某些特征上是一致的，所以在她们之间做比较的时候，就能够排除这些因素的影响。譬如，Dr. Herbst以同医院，同时间生产做匹配，就排除了病例和对照的母亲们因为在不同医院，或者是不同时间就诊（我们管这样的因素叫做混杂因素）产生的误差，而仅仅观察她们妊娠期的吸烟情况，DES治疗等所造成的区别。

在控制混杂因素的影响之外，匹配还能提高研究的效率。这是什么意思呢？因为病例和对照按照提前限定的混杂因素匹配了，那么他们之间的其他任何不同，都可能和我们的分析相关，换句话说，每一个研究对象提供的有用信息量增加了，这提高了统计分析的把握度，并且缩小了所需的样本量。这也是为什么，Dr. Herbst的研究，虽然只有8个病例+32个对照，但是结果仍然让人信服的主要原因之一（当然，提出好的临床问题是关键！）。

在实际应用中，特别是病例数较少的情况下，往往需要通过匹配对照，来控制混杂，获得可靠的结论。值得注意的是，如果对照是通过匹配得到的，在分析数据的时候需要使用相对应的分析方法，而不能使用普通的t检验，卡方检验等。Dr. Herbst分析他的配对数据时使用了配对卡方检验（Pike与Morrow）和配对t检验。其他常用的方法包括McNemar检验，条件logistic回归等等，应该根据研究目的和数据情况选择。

同时，匹配的研究方法也存在一些局限。包括有些情况下匹配对照不易获取，匹配过度等等。而且， 一旦研究人员确定使用某个变量进行了匹配，那么就无法从数据中研究它和疾病发病之间的关系，于是从研究数据本身，我们无法判断是否存在过度匹配的问题，只能通过临床知识解释。所以也不能盲目匹配，避免匹配过度。

今天我们从DES的历史，FDA如何通过两个病例对照研究就发布了“孕妇禁用DES”的公告，讲到了病例对照研究，以及在其中进行匹配的优缺点。

Take home message：

• 质量高的小样本的观察性研究也能提供靠谱的医学证据

• 我们可以通过病例对照研究探索疾病的病因

• 病例很少，难以获得的时候可以通过匹配对照的方式控制样本量

• 当然，最重要的，还是要保持对医学的灵敏嗅觉，和对科学热忱的探索之心

参考文献

1. N Engl J Med. 1971;284(15):878-81.

2. Cancer. 1970;25(4):745-57.

3. CA Cancer J Clin. 1972;22(5):292-5.

4. N Engl J Med. 1971;285(7):390-2.

5. Selected Item from the FDA Drug Bulletin—November 1971: Diethylstilbestrol Contraindicated in Pregnancy, Calif Med. Feb 1972; 116(2): 85–86. v.116(2)

6. CDC. DES update home. https://www.cdc.gov/des/index.html