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ctDNA检测或可成为免疫治疗的biomarker，但患者受益大吗？

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2021-10-20 来源 : VIP说

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免疫治疗是近几年癌症领域的新兴疗法，其主要作用机制为重新激活患者自身免疫系统，达到识别和杀伤肿瘤的目的，免疫治疗为未来晚期癌症治愈打开新的突破口。

鉴于免疫治疗只能让20%-30%左右的患者长期获益，因此如何有效的筛选目标获益人群一直是研究者和临床医生关注的问题。既往广大科研者做了很多研究尝试，初步探索到了一些免疫治疗的bimarker，比如PD-L1，TMB，MSI，dMMR等，但仍无法完全有效的区分出获益人群。

最近在Nature Cancer发表的一篇文章“Personalized circulating tumorDNA analysis as a predictive biomarker in solid tumor patients treated withpembrolizumab”研究者发现患者在接受免疫治疗过程中，肿瘤释放到血液中的循环肿瘤DNA（ctDNA）水平变化，可预测患者免疫治疗疗效。

ctDNA检测重大突破可预测免疫治疗疗效

该研究是一项前瞻性II期临床研究(NCT02644369)，主要评估五组平行队列 [头颈部鳞状细胞癌（SCCHN）、三阴性乳腺癌（TNBC）、高级别浆液性卵巢癌（HGSOC）、恶性黑色素瘤（MM）和混合实体瘤（MST）]的患者使用pembrolizumab治疗后ctDNA水平变化与免疫疗效的相关性。

研究共纳入了106名患者，所有患者均接受抗pembrolizumab治疗，中位治疗周期是3（1-35）。其中对94例患者的316个连续血浆样本进行ctDNA检测（研究者基于每个患者肿瘤DNA中体细胞突变情况，定制个性化ctDNA目标基因检测，每个患者检测的ctDNA基因个数不超过16个），分别对每个患者的基线和每3周一次血液样本进行采集。

具体研究结果如下：

（1）通过基线ctDNA水平差异分析发现，基线ctDNA低于中位基线ctDNA的患者总生存率（OS）和无进展生存率（PFS）更长（HR=0.49；HR=0.54）。且基线ctDNA水平低的患者临床获益率（CBR）和客观缓解率（ORR）也更高。

▼ ctDNA基线水平与OS和PFS相关

（2）为探索治疗早期ctDNA水平变化是否可预测患者免疫治疗的获益情况。研究者分析了73例患者在接受至少3个周期pembrolizumab治疗后的ctDNA水平（ctDNAC3）变化情况。

33例患者的ctDNA水平较基线下降，其中有14例患者病情达到客观缓解（PR）；而在40例ctDNA水平较基线上升的患者中，仅有1例出现客观缓解（OR=28.74）。

▼ 患者ctDNA水平从基线到C3的变化及临床反应和生存率

（3）在治疗3周后ctDNA水平较基线下降患者中，同样与较好的CBR，OS，PFS有关。

▼ ctDNA的动态变化与OS和PFS之间的关系

（4）患者治疗后ctDNA水平降低可能作为免疫治疗的biomarker，且独立于肿瘤突变负荷（TMB）和PD-L1表达水平。同时，将治疗第三个周期患者ctDNA水平变化联合实体瘤的疗效评价标准（RECIST）的风险分组，可更精准的预测患者的生存期（OS）。

▼ RECIST与ctDNA动态变化联合的风险分组可精准预测OS

（5）监测期间ctDNA水平较基线有所上升的患者与疾病进展及较差的生存期有关（mOS为13.7个月）；而监测期间ctDNA水平低于基线水平，但未完全清除的情况下，患者对免疫治疗响应不同，但整体生存期更长（mOS为23.8个月）。

如果患者ctDNA在治疗过程中被清除（即基因检测检测不到ctDNA），此类患者的临床预后最好，在中位随访时间长达25.4个月的情况下，患者的OS可达100%。

▼ ctDNA的变化与OS的关系

（6）另外与传统的影像学评估相比，ctDNA清除情况能更早的预测患者免疫治疗疗效。因此，监测ctDNA水平的动态变化在预测患者免疫治疗疗效上具有更大优势。

▼ ctDNA消除与放射学方法的比较

总体来说，患者在接受3周期及以上的pembrolizumab治疗后，若患者的ctDNA水平下降，则患者免疫治疗疗效较好，生存期更长；尤其是那些在接受免疫治疗之后检测不到ctDNA的患者，获益最大，生存期最长。且与传统影像学评估相比，监测ctDNA的变化可较早的预测患者对免疫治疗的响应情况。

ctDNA检测的机遇与挑战

近年来，随着免疫治疗在临床的广泛应用，为了更好的筛选优势人群，研究者在蛋白水平、细胞水平、病毒、微生物和基因水平做了诸多尝试，随着二代测序技术（Next generation sequencing, NGS）的发展，NGS不仅可指导驱动基因突变患者的精准靶向治疗，也在免疫治疗中起到一定作用，如大家所熟知的免疫治疗的biomarker，如PD-L1、TMB、MSI-H/dMMR，POLE/POLD1/EGFR等正负向基因及一些共突变基因等等，都是从基因层面筛选获益人群。

当然ctDNA检测也是基因层面的一种检测方式，用以预测患者免疫治疗的疗效。ctDNA检测有其独特的优势，但也存在局限性。如何精准有效的使用ctDNA检测也一直备受关注。

什么是ctDNA? ctDNA有哪些特点？

循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA），是一种存在于血浆或血清、脑脊液等体液中的细胞外DNA，是游离DNA（cell-free DNA，cfDNA）中的一种，ctDNA的主要来源包括：坏死的肿瘤细胞；凋亡的肿瘤细胞；循环肿瘤细胞。

ctDNA在很多肿瘤类型中都广泛存在，但数量少而且能够检测到的突变位点所占的比例很低。ctDNA片段大小通常为160-180 bp，在血液中半衰期2小时，携带有SNP（点突变）、InDel（插入缺失）、CNV（拷贝数）、fusion（融合基因）等突变信息，随人体血液循环系统中不断流动，可实时反映患者肿瘤发展情况。

▼ 血液中ctDNA的类型

ctDNA检测有哪些优势？

1）取样方便：微创、取样便捷、易获取

ctDNA检测通常只抽取血液即可对肿瘤细胞DNA进行分析，避免穿刺、手术等有创方式采集肿瘤组织带来的风险。ctDNA检测可以实现实时、多阶段个体化诊疗。

2）检测技术较成熟：灵敏度和准确性较高

利用NGS检测ctDNA，可检测低至0.1%的低频突变。ctDNA检测在肿瘤的早期诊断、治疗、病情监测及预后的评价具有重要的临床价值。ctDNA检测或可成为肿瘤个体化诊疗的理想biomarker。

3）检测全面：应用范围广

几乎所有肿瘤细胞都可以将衰老凋亡的DNA片段释放到血液中，尤其是晚期肿瘤患者，因此ctDNA监测能实时反应患者的肿瘤情况。

4）ctDNA检测可提供对肿瘤基因组的综合描述，因为ctDNA从多个不同肿瘤区域或多个病灶处释放，ctDNA分析可以发现组织活检中无法发现的体细胞突变。

5）ctDNA深度测序可以发现肿瘤内异质性和只在部分细胞中出现的基因突变。

▼ ctDNA的潜在应用

ctDNA检测的局限性有哪些？

1）ctDNA检测样本前处理过程中存在众多不确定因素，如抽血、采集、处理、储存、运输、DNA提取纯化，这些变量可能会影响样本质量、DNA的提取等，同时患者相关的生物学因素也可能会影响患者血液中游离DNA的释放，如吸烟、贫血、炎症类非恶性疾病等，都会影响后续的检测评价。目前这方面的研究还很有限，诸多问题尚待解决。

2）评价血浆ctDNA检测准确性和特异性的方法主要是通过与配对组织样本检测进行方法学比对。研究表明，血浆ctDNA检测与组织检测存在不一致情况，该情况除了受到分析性能的影响，也可能受其他生物学因素（如癌症类别、肿瘤分期、肿瘤空间和时间的异质性、组织血浆取样时间差等）影响。

▼ 不同晚期肿瘤患者的血浆ctDNA检出存在差异

3）由于血浆中ctDNA含量较低，对于检测下限的研究很重要。而目前，不同突变类型的最佳检测下限仍不确定，可能会根据预期用途而变化。

4）不同检测平台ctDNA检测能力存在差别，未来的研究应考虑进行更多大型的跨平台比对研究。

5）ctDNA检测平台和规则未统一化，不同检测panel和测序深度均会对ctDNA检测结果产生影响，尤其是低频突变，对各检测公司的检测能力要求较高。

6）纪念斯隆·凯特琳癌症中心（MSKCC）和GRAIL联合研究团队在《自然》子刊发表的文章指出：癌症患者血液中大部分突变并非来自于肿瘤细胞，而是血液中白细胞。在癌症患者的cfDNA中，克隆性造血带来的变异可能占53.2%；而在健康的志愿者体cfDNA中，可高达81.6%。每个样本至少需要高达60000×的测序深度才能较好的分辨克隆性造血的干扰，可想而知测序成本有多高。另外白细胞DNA的检测也是必不可少的，用以扣除一定的克隆性造血突变。如何有效扣除ctDNA检测结果中克隆性造血突变带来的干扰，仍是基因检测行业面临的一大难题。

克隆性造血突变是cfDNA中非肿瘤突变的最可能来源

7）研究发现，体内检测到ctDNA的患者比例与肿瘤进展的时期相关。有47%被检测到ctDNA的患者处在肿瘤Ⅰ期，而55%，69%，82%的病人分别处在Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ期。由于较早期患者，肿瘤DNA脱落较少，因此存在部分患者基线检测不到ctDNA水平的情况，从而造成漏检或假阴性。

▼ ctDNA在局部和非局部恶性肿瘤中的检出情况

8）ctDNA检测基因变异频率与临床疗效相关的cutoff值暂不确定，目前暂无大型研究探索突变频率与临床获益的相关性。

9）尽管目前在少量的研究中建立了ctDNA水平与治疗疗效间的关系，但目前该应用的临床有效性证据尚不足，也缺乏有力的临床实用性证据，需要进行进一步严格设计的临床研究。

10）全外显子检测价格不菲，尤其对血浆ctDNA检测，对测序要求更高，多次采样连续监测，目前还只在临床研究阶段，并未进入临床，如何让更多患者从中获益，还有待未来的研究探索。

因此，尽管ctDNA检测在肿瘤诊疗领域显示出诸多优势，但目前还存在诸多待研究的问题，尤其在临床有效性和临床实用性证据方面，除了个别已批准的产品在一定程度上表明了其临床用途外，大多数用于癌症筛查、治疗方案选择、疗效监测、残留病灶检测领域的检测都缺乏有力的临床证据，现阶段不宜在临床广泛开展。

ctDNA检测对免疫治疗作用的展望

ctDNA检测不仅在靶向治疗中得以应用，在免疫治疗中也体现了其独有的价值。尤其对于晚期癌症患者而言，准确判断患者能否从免疫治疗中获益至关重要，有效的判断不仅能最大程度保证患者权益，降低不必要的风险，同时避免患者不必要的花费，让更多优势人群从中获益。

虽然目前由于诸多因素的影响，ctDNA实时监测对于临床患者治疗指导的可及性较低。但相信随着科研的进步、技术的发展及科研人员的不断探索，ctDNA检测的优势会越来越明显，个性化精准诊疗的时代即将到来，量身化定制的诊疗方案将会让更多患者受益。　

参考文献

1. Bratman, S.V.,Yang, S.Y.C., Iafolla, M.A.J. et al. Personalized circulating tumorDNA analysis as a predictive biomarker in solid tumor patients treated withpembrolizumab. Nat Cancer (2020).

2. Merker J D, OxnardG R, Compton C, et al. Circulating Tumor DNA Analysis in Patients With Cancer:American Society of Clinical Oncology and College of American PathologistsJoint Review[J]. Journal of clinical oncology, 2018: JCO2017768671.

3. Vietsch EE, GrahamGT, et al. Detection of Circulating Tumor DNA in Early- and Late-Stage HumanMalignancies. Sci. Transl. Med, 6(224): ra24. 2014.

4. Hong B, Zu Y, et al.Detecting Circulating Tumor Cells: Current Challenges and New Trends.Theranostics, 2013, Vol.3, Issue 6.

5. https://www.mskcc.org/blog/many-mutations-detected-liquid-biopsy-tests-do-not-come-cancer-cells-msk-study-finds.