前言

细胞因子(Cytokine)是由免疫细胞产生的小蛋白质(通常<30 kDa)，在维持生理免疫稳态和调节病理生理过程(如癌症和自身免疫性疾病)中发挥重要作用。细胞因子根据其受体的构象分为不同的亚类，包括趋化因子、干扰素(IFNs)、白细胞介素(ILs)和肿瘤坏死因子(TNFs)。

鉴于它们在调节免疫反应中的重要作用，许多细胞因子已被确定为治疗各种癌症的候选药物。迄今为止，包括重组IL-2、IFNα和TNF在内的几种细胞因子已被批准用于临床癌症免疫治疗。然而，由于脱靶导致的毒性和不显著的疗效导致细胞因子的临床应用受到了极大限制。因此，具有高特异性、高选择性和更长半衰期的细胞因子工程是细胞因子药物发挥其最大治疗潜力的一种有希望的方法。随着细胞因子结构生物学和合成生物学的发展，研究者们已经开发了多种聚合细胞因子偶联物和肽细胞因子融合物，以提供具有长半衰期、强特异性和低免疫原性的治疗性细胞因子[1](表 1)。

表1 细胞因子工程策略的最新进展

在这篇文章中，我们将重点介绍利用分子工程和化学工程靶向癌症免疫治疗的细胞因子最新进展(图1)。

图1 癌症免疫治疗背景下的细胞因子工程策略

1、治疗性细胞因子的分子工程

分子工程策略旨在通过将细胞因子与其他蛋白质结构域(例如抗体片段)融合或通过使用密码子诱变改变蛋白质的分子结构来增强细胞因子的治疗特性。这些技术已被证明成功地克服了天然细胞因子的一些缺点，包括剂量限制性毒性、脱靶效应、半衰期短和活性低等。

1.1免疫细胞因子
将细胞因子靶向递送至肿瘤微环境(TME)可以触发强大的抗肿瘤免疫，并将所谓的免疫“冷”肿瘤转变为具有高免疫细胞浸润的“热”肿瘤。抗体细胞因子融合蛋白，称为免疫细胞因子，由细胞因子与全尺寸抗体或抗体片段融合组成，这为分子提供了靶向肿瘤相关抗原的能力。 Dougan等人[2]开发了一种羊驼衍生的仅重链片段(VHH)，靶向与IL-2或IFNγ融合的程序性死亡配体 1(PD-L1)，用于治疗对天然免疫检查点阻断抗体无反应的胰腺导管腺癌。 此外，在Weiss等人[3]的一项研究中，开发了几种含有不同L19 衍生片段的免疫细胞因子以及一种针对肿瘤相关细胞外纤连蛋白表位的抗体，用于治疗胶质母细胞瘤。以单链可变片段(scFv)或双抗体(scFvs二聚体)形式的L19片段与TNFα和IL-12的融合可以在小鼠模型和患者中实现有效的抗肿瘤活性。 1.2诱变 诱变技术可用于直接设计细胞因子，并改变受体的结合位点特异性和亲和力。目前，不同的诱变系统已应用于细胞因子，包括定点诱变和基于组合库的平台。定点合理诱变是基于对蛋白质界面内氨基酸突变时自由能变化的预测。然而在细胞因子受体相互作用的情况下，潜在的能量是极难预测的。出于该原因，定点诱变方法主要用于削弱受体-细胞因子相互作用。 1.3  IL-2 IL-2是一种被广泛探索的诱变细胞因子，它通过促进免疫细胞增殖、分化和细胞溶解活性在免疫应答中起关键作用。在过去的几十年中，野生型IL-2已在临床上用于治疗多种癌症，但会引起严重毒副作用。为了在癌症治疗中激活细胞毒性T细胞，许多工程改造都集中在改变 IL-2 对不同受体亚基的亲和力上。 Wittrup和Garcia团队[4]率先开发了几种 IL-2 变体，这些变体具有重定向到一个不同的 IL-2R 亚基的特异性，导致细胞毒性T细胞和NK细胞优先扩增。虽然工程细胞因子提供了一种有效的工具来靶向不同的内源性免疫群体，但它们仍然无法精确靶向过继转移的细胞。 Sockolosky 等人[5]最近的研究发现，IL-2可以通过使用正交(邻位)细胞因子受体系统重新特异性定向到过继转移的T细胞。正交IL-2/IL-2R由工程化的IL-2和IL-2R组成，不会与野生型(WT)细胞因子和受体发生交叉反应(图 2)。

图2 正交IL-2/IL-2R对的示意图 

1.4  IL-18

除了 IL-2，最近还使用了其他细胞因子进行诱变。在尝试增强IL-18的抗肿瘤活性时，Zhou等人[6]使用定向进化来设计一种“抗诱饵”IL-18变体(DR-18)，它不与诱饵受体IL-18BP结合，从而保持其在循环中的活性，以维持结合肿瘤浸润淋巴细胞的能力(图 3)。

图3 DR-18技术的示意图

2、治疗性细胞因子的化学工程

除了通过修饰其氨基酸序列来改造细胞因子外，另一种改善其药理学特性的方法是结合聚合物或肽。应用最广泛的是蛋白质与聚乙二醇(PEG)的共价偶联，称为聚乙二醇化。聚乙二醇化在延长细胞因子的半衰期方面取得了巨大成功，已有几种临床的聚乙二醇化细胞因子被批准。尽管取得了一定进展，但该方法仍存在非特异性偶联引起的蛋白质生物活性变化以及PEG的不可降解性等问题。

2.1PEG的替代品

合成多肽与治疗性细胞因子的化学偶联，称为PEPylation，由于其具有出色的化学模块化和更高的生物降解性，从而成为了PEG的有效替代品，然而PEP化细胞因子的受体结合结构域通常没有经过任何修饰，因此源自细胞因子多效性的脱靶毒性风险仍然存在。

最近，Wang等人[7]利用TME中高表达的基质金属蛋白酶(MMPs)，设计了一种肽-细胞因子偶联物，通过IFNα结构和合成多肽之间的MMP响应肽序列连接(图4)。在高浓度MMP存在下，肽底物被切割，蛋白质活性可以立即恢复。

图4 基质金属蛋白酶(MMP)反应性IFNα的示意图

2.2细胞外基质靶向细胞因子

肿瘤微环境(TME)包含基质细胞以及不断发展的细胞外基质(ECM)。胶原(Collagen)是 ECM 的主要成分，有助于组织的分子结构和机械性能。与健康组织相比，肿瘤组织中含有更多的胶原。通过将胶原结合域(CBD)与表皮生长因子受体 (EGFR) 特异性抗体片段融合，说明胶原可以作为一个有希望的靶标。最近，开发了多种结合 ECM的癌症疗法以增强肿瘤靶向性。

Hubbell团队[8]通过将 IL-2 与对I型和III型胶原具有高亲和力的肽融合，显示了 CBD 结合细胞因子的潜力。与未修饰的细胞因子相比，CBD修饰的细胞因子增强了 CD8+ T 细胞的肿瘤浸润并实现了更高的抗肿瘤功效。 IL-12 被认为是一种潜力巨大的抗肿瘤细胞因子，可以作用于先天和适应性免疫系统。然而，在临床试验中给予 IL-12 会导致在健康组织中的高积累和在肿瘤组织中的有限渗透。lumican 是一种结合I型胶原和IV型胶原的蛋白质，Wittrup团队[9]最近研究表明，可将IL-12 与 lumican 融合，瘤内注射 lumican 偶联的 IL-2 和 IL-12 能诱导细胞因子在肿瘤基质中的保留。 Mansurov等人[10]开发了可以静脉给药的肿瘤靶向CBD-IL-12疗法(图 5)。CBD-IL-12给药可导致B16F10和EMT6肿瘤中的细胞因子积累，促进肿瘤内 IFNγ产生和CD8+ T细胞募集。

图5 CBD-IL-12的示意图

总结

基于细胞因子的免疫疗法已被用于治疗各种肿瘤。然而，治疗性细胞因子的显著毒性和微弱疗效为临床转化带来了重大挑战。免疫细胞因子以及化学修饰的细胞因子保持其多效性以靶向表达其受体的任何细胞类型。这种效应仍然是细胞因子衍生毒性的主要原因，并且是临床转化的一个相当大的障碍，因此在所需免疫细胞与脱靶细胞的激活之间找到最佳平衡仍然是一个关键挑战。总之，不断增长的细胞因子工程策略工具将进一步刺激基于细胞因子的智能免疫疗法的发展，并提高疗效和安全性。

主要参考文献 

[1] Bonati, Lucia, Li Tang. Cytokine engineering for targeted cancer immunotherapy. Current opinion in chemical biology. 2021, 62: 43-52.

[2] Dougan M, et al. Targeting cytokine therapy to the pancreatic tumor microenvironment using PD-L1–specific VHHs. Cancer Immunol Res. 2018, 6:389–401.

[3] Weiss T, et al. Immunocytokines are a promising immunotherapeutic approach against glioblastoma. Sci Transl Med. 2020, 12:1–11.

[4] Liu DV, et al. Engineered interleukin-2 antagonists for the inhibition of regulatory T cells. J Immunother. 2009, 32:887–894.

[5] Sockolosky JT, et al. Selective targeting of engineered T cells using orthogonal IL-2 cytokine-

receptor complexes. Science. 2018, 359:1037–1042.

[6] Zhou T, et al. IL-18BP is a secreted immune checkpoint and barrier to IL-18 immunotherapy. Nature. 2020, 583:609–614.

[7] Wang H, et al. Enzymeactivatable interferon-Poly(a-amino acid) conjugates for tumor microenvironment potentiation. Biomacromolecules. 2019, 20:3000–3008.

[8] Ishihara J, et al. Targeted antibody and cytokine cancer immunotherapies through collagen affinity. Sci Transl Med. 2019, 11:1–12.

[9] Momin N, et al. Anchoring of intratumorally administered cytokines to collagen safely potentiates systemic cancer immunotherapy. Sci Transl Med. 2019, 11:1–14.

[10] Mansurov A, et al. Collagen-binding IL-12 enhances tumour inflammation and drives the complete remission of established immunologically cold mouse tumours. Nat Biomed Eng. 2020, 4:531–543.

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作者 | 七月