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作为一种近年来刚被发现的膜性细胞器，迁移体的研究发现引人注目，但其形态、发生机制和生理功能等研究都处在初期阶段;下面这篇文献是发现迁移体生理功能的经典文献，以斑马鱼胚胎为研究对象，发现了迁移体在器官形态发生和发育过程中的生理功能。

斑马鱼早期胚胎

迁移体在斑马鱼胚胎发育中的作用

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今天带来的思路来自清华大学-北京大学生命科学联合中心生物膜与膜生物技术国家重点实验室，俞立团队于2019年8月1日发表在Nature Cell Biology（IF=28.824）上题为“Migrasomes provide regional cues fororgan morphogenesis during zebrafish gastrulation”的文章，即斑马鱼原肠胚形成期间迁移体为器官形态发生提供了区域性提示。

迁移小体是迁移细胞中新发现的细胞器。在细胞迁移过程中，从细胞尾部拉出称为回缩纤维的突起。直径达几微米的迁移小体在收缩纤维上生长。当细胞迁移离开时，回缩纤维分解，留下迁移小体。然后迁移小体破裂并将其内容物释放到环境中，这个过程称为迁移。目前尚不清楚迁移小体在活体动物中的生理功能。鉴于斑马鱼的光学清晰度和非母体发育促进了高质量的成像，并且原肠胚形成过程中细胞的强劲运动，作者选择斑马鱼胚胎作为研究迁移的模型系统。作者研究表明微粒体是信号传导的细胞器，可提供特定的生化信息来协调器官的形态发生。

 研究内容

1、原肠胚形成过程中迁移小体的形成

通过微分干涉对比显微镜观察了盾构阶段的斑马鱼胚胎，在细胞外空间发现了许多细胞突起，许多囊泡附着在突起上（图 1a）。Tspan4被鉴定为迁移体的标记。为了研究囊泡的性质和过程，将 tspan4a-绿色荧光蛋白 (GFP) 信使 RNA 注射到八细胞阶段的单个胚胎的一个卵裂球中，以进行克隆标记。在屏蔽阶段，观察到许多Tspan4a-GFP 阳性囊泡与投影相连（图 1b），类似于体外培养的哺乳动物细胞中的回缩纤维和迁移小体（图 1c）。 对表达 Tspan4a-GFP 的原肠胚进行了延时成像分析表明，这些结构几乎总是出现在与细胞体迁移方向相反的一侧（图1d），表明它们是由迁移细胞留下的。当细胞迁移离开时，囊泡与突出物分离并被留下（图 1e），这是迁移小体生物发生的特征。此外还发现了大量未连接的细胞外 Tspan4-GFP阳性囊泡（图 1f）。这些囊泡的单个光学切片中的 GFP 强度和直径与连接的囊泡中的相当（图 1g）。这一观察结果表明，这些未连接的囊泡可能是与回缩纤维断开的迁移小体。在斑马鱼原肠胚形成过程中，胚胎细胞产生长突起和囊泡，其大小、形态、拓扑、分子组成和生物发生过程类似于培养的哺乳动物细胞中回缩纤维上的迁移小体。可以认为斑马鱼原肠中的长突起是收缩纤维，囊泡是迁移体。

2、斑马鱼胚胎中迁移小体的时空分布

通过过表达 PH-GFP 标记胚胎中的迁移小体，将 PH-GFP mRNA 注射到八细胞阶段的单个胚胎的一个卵裂球中，使用四维（4D）成像观察注射的胚胎以计算每个时间点的迁移数。使用这种方法量化了 16 个胚胎中迁移小体的数量，发现迁移小体数量在受精后 5.5小时 (h.p.f.) 显著增加，并在 7 h.p.f. 达到峰值，此后没有显著变化（图 1h）。迁移小体在细胞之间的胞外空间袋中富集（图 1i、j）。一些口袋（pockets）包含附着在回缩纤维上的密集迁移网络（图 1i），而许多迁移小体与其他口袋中的回缩纤维断开连接（图 1j）。使用 TEM观察到大袋的细胞外空间（图 1k），其中包含许多囊泡或囊泡簇，位于卵黄合胞层旁边的边缘中内胚层细胞之间。在原肠胚形成过程中会形成大量的迁移小体，迁移小体存在于中内胚层细胞之间的胞外袋以及胚盘边缘和卵黄合胞层之间的袋中。

3、四跨膜蛋白 4a 和 7 以及整合素 β1b 调节斑马鱼原肠中迁移小体的形成

尽管 itgb1b^-/-突变体在胚胎上是致命的，但它们可以在整个原肠胚形成阶段存活，因此可以研究原肠胚形成过程中 itgb1b 缺陷胚胎中迁移小体的形成。为了量化斑马鱼胚胎中迁移小体的形成，对斑马鱼原肠胚进行了 z-stack 成像（图 2a）。首先分析来自 itgb1b^+/-杂交的胚胎的迁移小体数量，然后单独进行基因分型。与体内培养的哺乳动物细胞类似，itgb1b^-/- 胚胎在原肠胚形成阶段形成的迁移小体显著减少。

四跨膜蛋白 4 在迁移小体上富集，并已被确定为迁移小体的标记物。作者推测四跨膜蛋白可能调节迁移小体的形成。斑马鱼中已经注释了 40 多个四跨膜蛋白基因。首先通过 RNA 测序检查了盾构阶段斑马鱼胚胎中单个四跨膜蛋白的表达水平（图 2b）。选择了在斑马鱼原肠中表达水平最高的 tspan7 和 tspan4a用于进一步研究。原位杂交验证了tspan4a 和 tspan7 在原肠胚中的表达。接下来，发现 tspan4a 和 tspan7 的敲低确实显著阻止了迁移小体的形成。来自杂合杂交的 tspan4a 和 tspan7 纯合胚胎发育正常，可能是由于它们的母体产物的存在。为了完全消除任何可能的母体效应，使用 tspan4a^-/-或tspan7^-/-成年鱼进行自交以产生母体合子（MZ）突变体，结果发现在屏蔽阶段 MZtspan4a 和 MZtspan7 突变体胚胎中迁移小体的数量显著减少（图 2c-f），而这些突变体中细胞的迁移速度没有降低（图 2g）。

4、斑马鱼器官形态发生受 tspan4a 和 tspan7 调控

发现MZtspan4a 和 MZtspan7两种突变体的整体原肠细胞运动都没有显著改变；此外也没有观察到背腹轴形成或会聚和延伸的任何明显缺陷。这些结果表明原肠胚形成在 MZtspan4a 和 MZtspan7 突变体胚胎中基本正常。通过 ISH 使用肝原基 (cp)、胰芽 (pdx1)、肠球和其他内胚层衍生物 (foxa3)、心管 (myl7) 和前肾小管 (slc20a1a) 的标记物，检查了 48 h.p.f. 时的器官形态发生，发现器官形态发生在 MZtspan4a 或 MZtspan7 突变体中受损。许多器官出现形态变形或体积缩小，此外还注意到侧向性缺陷，包括肝原基、肠球和胰芽的左右反转、肝原基的双侧重复和右循环心管（图3a）。在 MZtspan4a 和 MZtspan7 突变体中，当用任何单个标记物探测时，大约 20% 的胚胎显示异常。作者还使用 nanos3 作为标记检查了原始生殖细胞的分布，发现大约 20% 的胚胎具有异常分布的原始生殖细胞（图 3a）。当同时检查所有六个标记时，两种突变体的约 65% 的胚胎在至少一个器官中表现出可见的异常（图 3b、c ），约 30% 的胚胎表现出各种侧向缺陷（图 3d）。

5、注射外源性迁移小体部分挽救了 MZtspan4a 和 MZtspan7 突变体的器官形态发生

作者推测，如果有缺陷的迁移小体的形成是器官形态发生异常的主要原因，也许能够通过添加从野生型 (WT) 胚胎中分离的迁移小体来挽救表型。于是，从 WT 原肠胚中纯化了迁移小体，并在原肠胚形成前将它们注射到 MZtspan4a 和 MZtspan7 突变体胚胎中（图 3e，f），发现只有约 25% 的注射了迁移小体的 MZtspan4a 和 MZtspan7 胚胎在器官形态发生方面具有可见的缺陷（图 3g，h）。根据这些数据，得出结论，促进迁移小体形成可能是 tspan4a 和 tspan7 在器官形态发生中的主要作用。

6、趋化因子、形态发生素和生长因子富含迁移小体

从大约 20,000 个胚胎中分离出纯化的迁移小体和细胞体（图 4a），并通过 TEM（图 4b）和蛋白质印迹监测分离出的迁移小体的质量（图 4c）。这些样品被不同质量的标签标记（图4d）。发现 2,680 种蛋白质在迁移小体中富集了两倍以上，而 3,710 种蛋白质在迁移小体中消耗了两倍以上（图 4e）。因此，迁移小体的蛋白质组成与细胞体有很大不同。

在定量质谱分析中发现迁移小体富含多种信号分子，注意到趋化因子 Cxcl12a 和 Cxcl12b 在胚胎迁移小体内富集。 Cxcl12 在器官形态发生中起重要作用，斑马鱼中 cxcl12 的缺乏导致器官形态发生缺陷，这与在 MZtspan4a 和 MZtspan7 突变体中观察到的表型有些相似。因此，将Cxcl12作为研究重点。为了确认迁移中 Cxcl12 的富集，成功地合成针对斑马鱼 Cxcl12a 的特异性抗体，免疫染色和蛋白质印迹证实，内源性 Cxcl12a 确实在体内迁移小体（图 4f、g）和体外培养的斑马鱼胚胎细胞中高度富集（图 4h）。

7、器官形态发生需要 Cxcl12a–Cxcr4b 信号轴

Cxcl12a 在迁移小体中的富集增加了器官形态发生需要 Cxcl12a（配体）-Cxcr4b（受体）信号轴的可能性。使用 ISH 来验证 Cxcl12a 和 Cxcr4b 确实在原肠胚中表达。然后生成了 cxcl12a^−/− 鱼并获得了 MZcxcr4b 鱼，发现器官形态发生（包括侧向性）在两种突变体中都受损。将来自 WT 原肠胚的纯化迁移小体注射到 Cxcl12a morphant 胚胎中，以测试迁移小体是否可以传递 Cxcl12a 进行信号传递，发现这些迁移小体有效地挽救了器官形态发生和侧向性缺陷。得出结论，在原肠胚形成过程中，迁移小体可以作为 Cxcl12a 的来源。

8、Kupffer囊泡需要 tspan4a 和 tspan7 才能形成

众所周知，Kupffer囊泡 (KV) 在硬骨鱼的左右身体轴的建立中起着至关重要的作用。作者发现 KV 的形成在 MZtspan4a 和 MZtspan7 突变体中均受损，表现为具有较少纤毛的较小 KV（图 5a-c）。KV 异常的严重程度在个体突变胚胎之间差异很大。这可能解释了在 48 h.p.f. 观察到的形态发生器官缺陷严重程度的显著变化。作者发现从 WT 胚胎注射纯化的迁移小体可以挽救 MZtspan4a 和 MZtspan7 突变体中的 KV 大小和纤毛数量（图 5d-f）。作者还发现在 cxcl12a 和 cxcr4b 突变体中 KV 形成均受损（图 5g-i），表明 Cxcl12a-Cxcr4b 信号轴确实是 KV 形成所必需的。这些数据表明迁移小体通过提供 Cxcl12a 信号来调节 KV 形成，从而调节侧向性。

9、tspan4a 和 tspan7 是原肠胚形成过程中胚胎盾上 DFC 聚集所必需的

在斑马鱼中，KV 由一组称为背前行细胞 (DFC)的细胞形成。在原肠胚形成期间，DFC 迁移到胚胎盾牌的前缘。与胚胎盾中的其他胚盘细胞相比，DFC 不渐开线；相反，它们在外包期间保持紧密聚集。作者发现 MZtspan4a 和 MZtspan7 突变体中的 DFC 聚类都是异常的，其中很大一部分具有较小或分散的 DFC 簇（图 6a）。

如果 tspan4a 和 tspan7 通过调节迁移小体的形成影响 DFC 的迁移或聚集，则 tspan4a 和 tspan7 应以细胞非自主方式执行其功能。为了验证这一假设，进行了 DFC 移植实验。由于 sox17 在 DFC 中以高水平表达，作者在6-7 h.p.f时间点将 WT 的DFC 从 Tg（sox17：GFP）胚胎移植到 WT、MZtspan4a 和 MZtspan7 胚胎的 DFC 区域（图 6b），并在7-8 h.p.f. 时间点到早期体节阶段（12 h.p.f.）使用光片显微镜拍摄 4D 图像。发现移植的 DFC 在 WT 宿主胚胎的原肠胚形成期间作为胚胎盾的前缘上的紧密簇迁移，而在 MZtspan4a 和 MZtspan7 突变宿主中，移植的 DFC 在迁移过程中未能保持在一起并分散（图6c，d)。这些数据表明tspan4a 和 tspan7 是通过细胞非自主机制在原肠胚形成过程中聚集 DFC 所必需的。

10、迁移体在胚胎盾下的空腔中富集

Cxcl12a 在迁移小体中的富集表明迁移小体可能充当区域化学引诱物，在胚胎盾牌的前部吸引和保持 DFC。迁移小体在斑马鱼原肠胚的空腔中富集，这意味着在 DFC 下方可能存在富含迁移小体的空腔（图 1j）。 将高分子量荧光标记的葡聚糖注射到 Tg(sox17:GFP) 胚胎中来标记斑马鱼原肠中的腔，Tg(sox17:GFP) 胚胎在 DFC 中表达 GFP。快速三维 (3D) 成像显示荧光标记的葡聚糖在 DFC 下方的限定区域中积累（图 7a），表明 DFC下方有一个空腔。在检查的每个原肠胚的整个形成过程中，该腔都存在，并且 DFC 相对于腔的位置在原肠胚形成过程中没有变化。作者将此腔命名为胚胎盾腔。

通过在八细胞阶段将 tspan4a-mCherry mRNA 注射到 Tg（sox17：GFP）胚胎的卵裂球中并通过光片显微镜观察胚胎屏蔽腔来检查迁移小体是否存在于胚胎屏蔽腔中，发现迁移小体在胚胎屏蔽腔中高度富集（图 7b），而在 MZtspan4a 或 MZtspan7 胚胎中胚胎屏蔽腔中迁移小体的积累显著减少。作者还检查了注射的迁移小体（图 3e，f）是否在胚胎盾构腔中积聚，用 CM-DiI 对纯化的迁移小体进行染色，然后在 50% 包覆阶段将它们注射到 Tg(sox17:GFP) 胚胎中，发现注射的迁移小体归巢到正确的区域并在胚胎屏蔽腔中积累（图 7c）。基于这些数据，得出结论，迁移小体在胚胎盾构腔中积累（图 7d）。

11、迁移体是 DFC 的化学引诱剂

作者设计了一种体内化学引诱试验，从斑马鱼原肠胚中纯化了迁移小体，然后在 1% 低熔点琼脂糖中嵌入荧光珠，将对照和含有迁移小体的琼脂糖注射到 Tg(sox17:GFP) 原肠的腹面，其中标记了内胚层细胞和 DFC（图 7e）。 内胚层细胞和 DFC 留在注射了对照琼脂糖的原肠的背侧；然而，在注射了琼脂糖包埋迁移小体的原肠胚中，一组内胚层细胞和 DFC 被吸引到胚胎的腹侧并最终包围了琼脂糖（图 7f、g）。作者结合了cxcl12a 和 cxcl12b 吗啉代寡核苷酸，即在原肠胚形成阶段从 cxcl12a/b morphant 中分离的迁移小体，将迁移小体嵌入琼脂糖中并将它们注射到宿主胚胎中。结果表明，来自 cxcl12a/b morphant 的迁移小体吸引内胚层细胞和 DFC 的能力降低（图 7f、g ）。这表明 Cxcl12a/b 可能是迁移小体中的主要化学引诱物。发现Cxcr4b 和 Cxcr4a 确实在 DFC 中表达（图 7h）。此外，cxcr4b 突变体中 DFC 的迁移和聚类受到损害，这表明 Cxcl12a/b 是 DFC 的主要化学引诱物。总之，这些数据意味着迁移小体是 DFC 的化学引诱剂。

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