截取自NEJM

题外故事

1995年，住在柏林的美国男子Timothy Ray Brown被确诊为艾滋病。2006年，他又一次被病魔击中，这一次是急性髓系白血病。2007年，白血病复发后他采取了Hütter医生的建议，进行了一次特殊的异基因造血干细胞移植——骨髓来自一位对艾滋病“天然免疫”的相合供者。12年后的今天，他仍然是全球唯一被治愈的艾滋病患者。我们知道HIV病毒会作用于CCR5受体并侵入人体细胞，而这位对艾滋病“天然免疫”的供者体内存在一种罕见的名为CCR5-delta32的基因突变，这种突变能够使该基因失效，并让携带者抵抗主要HIV毒株。然而，全世界的人群中CCR5天然突变者如凤毛麟角，我们是否可以人为修饰并干扰CCR5的表达呢？预知后事如何，请听下文分解！

图：蒂莫西·雷·布朗（Timothy Ray Brown）

2016年5月，一位27岁的小伙子不幸被诊断为艾滋病（AIDS）合并T细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）。患者在使用抗逆转录病毒药物治疗1年后HIV感染得到控制，随后接受了6个疗程的ALL标准化疗方案并获得了形态学完全缓解（CR）伴MRD阴性（<0.01%）。中国骨髓库中有一位33岁男性正常供者的骨髓和他HLA全相合，伴有未突变的CCR5基因。2017年7月9日，患者清髓预处理后进行了异基因造血干细胞移植。

供者的外周血单个核细胞（PBMC）经磁珠分选出造血干祖细胞（CD34+ HSPCs），并应用CRISPR技术编辑CCR5位点。移植期间应用环孢素、甲氨蝶呤、巴利昔单抗（CD25抗体）、吗替麦考酚酯、糖皮质激素和他克莫司以预防和治疗移植物抗宿主病（GVHD）。 

研究旨在评估CRISPR-Cas9技术编辑HSPCs移植治疗罹患血液病伴HIV-1阳性患者的安全性和有效性。HLA全相合供者的PBMC经磁珠分选出CD34+HSPC后用无血清培养基培养48h后转染含Cas9蛋白和2条靶向CCR5 gRNA的核糖核蛋白复合体。转染后细胞培养2h。分选所余CD34阴性细胞和编辑后的CD34+细胞共同移植患者体内。移植前后对编辑细胞进行全基因组测序以分析潜在脱靶效应。

中性粒细胞和血小板植入分别发生在移植后的d13和d27，淋巴细胞数量和T细胞亚群亦在移植后上升，CD4+细胞数量在移植后第6个月逐渐恢复和稳定。完全供者嵌合状态在移植后第4周获得，并持续到移植后19个月。ALL的形态学完全缓解发生在移植后第4周并持续19个月。流式未检测到白血病相关表型的MRD。ABL标准化的WT1小于0.5%。全基因组测序检测到CD34+ HSPCs的CCR5插入或缺失效率为17.8%。以防基因编辑后的HSPCs无法长期植入， 分选出的CD34阴性细胞（占CD34+细胞的28.8%）亦同时移植。移植后的19个月内，CCR5在骨髓基因组的敲除比例波动在5.2%至8.28%（图B），且CRSPR介导的CCR5敲除可以在多种造血细胞中见到。（图C）

截取自NEJM

患者移植后未出现急性免疫反应。发热性中性粒细胞减少（3级）和菌血症（表皮葡萄球菌，3级）在移植后首2周发生，标准抗生素治疗可缓解。急性GVHD（皮肤，1级）、尿频尿急（1级）、巨细胞病毒血症（3级）和单纯疱疹再激活发生在移植后第2个月。未观察到CCR5基因编辑相关不良反应。 

为评估基因编辑后的脱靶效应，研究者对编辑的HSPC基因组进行了高通量测序。测序未检测到DNA裂解等脱靶效应。在移植后第15周、第12月、第19月，研究者再次进行测序，脱靶效应仍未被检测到。 

此前研究工作已证实，输注自体CCR5编辑的T细胞可以在抗逆转录病毒治疗期间减少患者的病毒负荷，提示CCR5敲除或能缩短抗逆转录病毒的治疗时间。本项研究中，在移植后7个月，当患者CD4+细胞已恢复正常且血清检测不到病毒RNA时，经患者知情同意短暂中止了抗逆转录病毒治疗。中止后第4个月，患者血清病毒负荷增长到了 3×10⁷，因此恢复用药。随后数月患者病毒负荷降回正常水平。

在先前各种基于HSPC的治疗探索中，外源DNA随机插入基因组减低了治疗的有效性，同时可能发生急性免疫反应或导致肿瘤形成。在本项研究中，Cas9核糖核蛋白应用非病毒转染法因而避免了外源DNA的插入及Cas9在靶细胞的长期存留（脱靶原因之一）。研究对移植前后的样本进行全基因组测序未发现单个核苷酸变异体、大缺失或染色体重排，患者亦未出现明显不良反应，以上均证实了该研究的安全性。但是，CCR5编辑的较低效率同样也限制了脱靶分析的深度。近来，有研究显示CCR5-Δ32的突变可能导致减寿发生，但本项研究中CCR5在造血系统内的编辑不会改变其在非造血组织的表达。CCR5 CRISPR编辑的 CD34+细胞移植对循环骨髓细胞的基因组产生的基因干扰低于8%，且未见基因编辑相关脱靶效应。