周济春

博士

浙江大学医学院附属邵逸夫医院肿瘤外科 主治医师
耶鲁大学与浙江大学联合培养肿瘤学博士，耶鲁大学 博士后
临床方面严格按照循证原则，开展以乳腺，甲状腺，胃肠道肿瘤等常见实体瘤的个体化精准治疗。基础研究方面主要围绕乳腺癌内分泌耐药机制及逆转策略，乳腺癌癌前病变开展转化医学研究
获2017年中国临床肿瘤学会（CSCO）“35 under 35”最具潜力年轻肿瘤医生称号，担任《中华乳腺病杂志（电子版）》中青年编辑委员会委员，《肿瘤综合治疗电子杂志》编委，《转化医学电子杂志》编辑委员会青年编委，Annals of Translational Medicine 专栏编辑
负责和以主要成员身份参与国家自然科学基金课题5项，科技部支撑项目1项及浙江省自然基金项目多项。已发表SCI论文30余篇，包括PNAS,   Nature Communications,  Oncogene, Nucleic Acids Research，EMBO Molecular Medicine等国际知名杂志，累计影响因子超过120分，被他人引用次数超过600次

周济春博士解读最新发表于顶级权威期刊自然杂志（Nature）的研究结果。该文以极具颠覆性的技术，对那些“突变意义不明”的BRCA1基因突变进行精准功能分析，解决上述困扰。本文将介绍以下内容：

• BRCA1基因突变研究现状；

• 饱和式基因组编辑技术横空出世的历史节点；

• 精准分析将近4000个BRCA1基因突变的技术要点；

• BRCA1基因突变检测结果精准分析的数据库资源；

• 当前研究技术可能存在的问题和未来发展方向探讨；

这篇题为“Accurate classification of BRCA1 variants with saturation genome editing”的研究论文发表于2018年9月的Nature杂志。这篇论文由于应用突破性技术解决关键性临床和基础问题，因此在业界掀起了热议浪潮，可以称之为具有轰动效应的“刷屏”研究结果。诸多权威杂志对该研究进行了极高的评价。

首先来介绍这研究的主角—BRCA1基因，该基因作为抑癌基因在功能方面具有多样性。但被人研究最多的是其具有参与DNA修复的功能，通过参与同源重组修复抑制肿瘤的发生。目前认为BRCA1基因发生突变，将导致癌症发生的几率急剧升高。

从1990年发现BRCA1基因突变可能是导致乳腺癌发病的关键因素以来，围绕BRCA1基因进行的研究层出不穷。截止2018年10月14日，Pubmed数据库可检索的已发表研究超过15000项，且近年该领域的研究热度有增无减。

西方国家在该领域积累了大量的研究数据，据悉美国已有超过200万的女性接受过BRCA1基因突变情况的检测。美国癌症研究所（NCI）的数据提示：BRCA1基因突变携带者70岁之前患乳腺癌的几率较无突变者显著升高。因此该基因突变的检测受到社会和公众越来越多的关注。

查询业界权威数据库ClinVar发现目前检测到的BRCA1基因突变位点高达7178个。如果我们仔细分析这些数据的构成会发现其中2672个BRCA1基因位点的突变为“突变意义不明”，即Variants of Uncertain Significance（VUS）。此外还有大量BRCA1位点突变属于“可能”良性、“可能”致病、或者目前研究“有争议”。VUS和其他“可能”突变的存在导致临床医生无法准确预测BRCA1基因突变携带者发生癌症的几率。这可能是部分需要而不愿意接受BRCA1基因突变检测的重要原因。毕竟谁都不愿意接受一个连结果都可能无法解释的检测，徒增心理负担。

一个新技术的诞生必然有其发生的土壤。万事俱备只欠东风，可以非常形象的描述一项技术井喷式发展的关键因素。介绍的这一研究是基于什么样的研究基础而横空出世的呢？首先，该研究团队早在2015年已经发表了利用饱和基因组编辑技术探讨基因突变功能，只是当时没有深入单个核苷酸突变体（SNV）。其次，众所周知，人类2万多个基因，哪些基因属于细胞存活的核心基因呢？同样在2015年，另外一个研究小组深入探讨了这个核心的问题。最后，CRISPR基因编辑技术的逐步成熟是上述两个研究得以顺利实施的关键。

研究内容摘要：VUS的存在极大限制了遗传学信息的临床应用，特别是BRCA1这一抑癌基因的突变所导致的BRCA1功能缺失（LOF）---女性发生乳腺癌和卵巢癌风险显著升高。尽管百万级别数量的女性曾经行BRCA1基因突变测序，但是大部分新发现突变的临床意义无法进行准确地界定。这篇研究使用饱和基因组编辑对BRCA1核心区域的13个外显子96.5%的单核苷酸突变体（SNVs）进行功能验证。将近4000个BRCA1基因SNVs的功能得到确认。并且研究结果与已有的数据库完美验证。共发现超过400个导致BRCA1基因功能缺失的错义突变SNVs，同时还发现将近300个扰乱BRCA1基因表达的SNVs。研究者预测这一研究结果可立即应用于BRCA1基因突变体的临床解读。此外该研究的方法可能可以扩展到另外重要基因的VUS的解读。

研究者选择了HAP1作为研究对象。HAP1属于单倍体细胞，因此DNA双链断裂修复主要需要同源重组修复。研究者首先通过大量的细胞实验验证了HAP1细胞存活的关键基因，其中包含BRCA1（DNA双链断裂后修复的核心基因），即这些基因功能的缺失将导致细胞的死亡。其次，研究者选择了BRCA1基因的两个核心区域RING和BRCT中的13个外显子作为研究对象。最后，研究者花费了大量的精力构建了SNV/Cas9/gRNA突变库，利用CRISPR技术逐个对HAP1中上述BRCA1基因13外显子的单核苷酸位点进行突变，并分析细胞死亡存活情况。

研究者通过一系列步骤最终筛选3893个单核苷酸突变体进行功能验证。

为了使研究顺利实施和结果更加稳定，研究者采用LIG4敲除的单倍体HAP1细胞（有助于在更加纯净的背景下进行分析BRCA1参与同源重组的功能）。

该研究共分析了BRCA1基因3893个单核苷酸突变体的功能，其中21.1%的突变可导致BRCA1基因功能缺失（基于BRCA1的功能研究，携带此类突变，发生癌症的风险急剧升高）。

当然，研究者也介绍了他们团队如何进行BRCA1基因某个位点突变的功能评分分析方法（比较复杂，但非常合理）。

研究者将其研究结果与现有的数据库进行比对，结果提示匹配度非常高，近乎完美，高度提示该研究结果可以立即用于临床BRCA1基因突变体临床意义解读。

此图是该研究最终结果的汇总，包括了研究发现的近400个BRCA1不同单核苷酸突变体是否导致BRCA1基因是否突变的全部结果。基于这些结果，研究者建立数据库，并公布在其研究机构的网站上以供公众免费查阅。任何人只要网络可及，都可以将自己的BRCA1基因突变位点输入后得到基于该研究的结果！！

与此同时，研究者也对不同位点突变导致BRCA1基因不同功能状态的机制进行了简单分析。其中89%导致BRCA1基因功能缺失的突变，并不导致其mRNA水平改变，提示此类突变可能影响BRCA1蛋白功能。另外还根据突变所处的不同位置进行了分析。

总的来说，这一研究将是强有力的研究工具（CRISPR基因工具发展出来的饱和式基因组编辑）+ HPA1单倍体细胞 + BRCA1（关键基因） + 大量人力物力（SNV/Cas9/gRNA突变库）有机而巧妙地结合，最终获得了革命性的研究成果。

• 饱和式基因组编辑（SGE）有望成为划时代的工具，能用于其他重要基因和分子通路的功能分析。其未来应用场景包括但不限于：基因突变临床意义解读、药物开发、靶点和生物标志物开发等领域。

• 该研究所阐述的结果仍然存在细胞特异性，不同的细胞、组织、脏器的情况可能完全不同。此外，细胞的代偿机制和多个位点综合突变（如不同突变组合等），是各种病理生理状态下真实存在的，远非该研究所能囊括，所需的工作量可能指数级增加。

• 本文涉及的BRCA1基因同源重组功能缺失，必然会导致癌症发生吗？众所周知，癌症的发生是多因素交互作用的结果。目前公认的BRCA1基因的致病性突变，也只是提示癌症发生的概率而已。因此该研究将BRCA1基因突变临床意义解读向前大大地推进了一步，但尚未完美。