在众多人类免疫检查点蛋白中，程序性死亡配体1（PD-L1）及其受体PD-1已经成为癌症治疗研究的关键靶点。尽管PD-L1免疫组织化学检测（IHC）是被FDA批准的检测方法，并已被广泛用于指导免疫治疗。但目前仍鲜有报道基于非侵入性技术的无创定量检测方法，用以实时监测免疫治疗的效果，提高免疫治疗成功率。
近日在Cancers（IF 6.1）发表的一篇文章“Quantifying PD-L1 Expression to Monitor Immune Checkpoint Therapy:Opportunities and Challenges ”总结了当前无创定量检测PD-L1表达的研究进展，并讨论了这些创新为指导免疫检查点治疗（ICT）提供的机遇和挑战。
在肿瘤微环境（TME）中，PD-L1的表达受到多种先天性免疫抵抗及适应性免疫抵抗机制的调控（表1）：（1）由肿瘤细胞遗传改变驱动的合成性表达PD-L1。如基因扩增，基因易位和UTR区域破坏。
（2）致癌基因信号通路的激活诱导。如，在T细胞淋巴瘤ALK / STAT3基因通路的激活；AP-1 / JAK / STAT基因通路激活中在经典霍奇金淋巴瘤；或是非小细胞肺癌（NSCLC）的EGFR 基因突变。（3）肿瘤细胞，基质细胞，内皮细胞，T细胞，APC和髓样细胞等引起的炎症刺激及相关信号传导机制。（4）PD-L1 在microRNA（miRNA）的mRNA水平上也受到表观遗传调控，以及泛素化，N-糖基化和棕榈酰化还严格调节了PD-L1在癌细胞上的表达量和稳定性。多项研究表明细胞周期蛋白CDK4在肿瘤细胞对免疫逃逸机制的调节中建立了细胞周期与免疫逃逸之间的联系。▼ 表1 影响PD-L1的表达调控机制
除此之外，内源性病毒、化学疗法和放射疗法也影响了TME中PD-L1的表达。化学疗法如奥沙利铂，环磷酰胺，阿霉素和紫杉醇已显示出可通过增强抗原呈递或抑制免疫抑制机制来发挥免疫调节功能，从而创造出可通过ICT激发的炎症环境。同样，辐射诱导的细胞凋亡后，抗原呈递增加，IFN-γ反应和促炎性趋化因子产生增加，这促进了T细胞向肿瘤的转运。放射疗法的免疫刺激作用导致肿瘤中PD-L1表达的增加，可以与ICT协同作用并发展为全身性抗肿瘤免疫力。
伴随PD-L1检测已被批准用于膀胱癌，乳腺癌，宫颈癌，胃/胃食管癌和NSCLC，并已被证明可用于指导NSCLC的预后。然而，基于IHC的检测在如何更直接、更全面、动态实时提供信息方面受到了创新技术的挑战。FDA现已批准了四种IHC测定方法，作为用于PD-1和PD-L1抑制剂的辅助和补充诊断方法。但不同的mAb克隆（22C3、28-8，SP263，SP142）采用不同的检测系统分析技术。三种测定法仅使用TPS，而第四种测定法同时使用TPS和IPS对患者进行分层治疗，从而需要创建每种测试和药物独特的评分方法。以上问题在一定程度上影响了早期IHC分析的准确性和可靠性，治疗前或档案肿瘤组织样品可能无法代表肿瘤在治疗开始时的免疫状态。鉴于肿瘤的时空异质性，即随着时间变化，病灶内或跨病灶采集的PD-L1水平的差异性并不罕见。用于IHC分析的小样本单次活检或胸腔积液仅占肿瘤的一小部分，无法全面反应肿瘤内外的免疫环境水平。如果检测样本来自单一患者不同解剖部位，一个病灶中PD-L1阳性的程度是不能预测另一个病灶中的阳性程度的。此外，病变的位置与免疫反应或缺乏免疫反应有关的数据均需要被实时观察记录。在尿路上皮癌、NSCLC和黑色素瘤中，转移到肝脏的肿瘤通常会导致不良的预后，而那些转移至淋巴结表现出较好的反应率。这些结果表明，深入了解组织特异性免疫调节对于开发有效的免疫系统至关重要。针对组织微环境的免疫疗法，提供高特异性，高图像对比度的PET成像，可以量化大多数组织中的PD-L1水平并整合到临床工作流程中，帮助实现上述这些目标。PET对重复测量肿瘤中的靶标大小非常有效，可预测对治疗的反应和无进展生存期，并有助于药物开发和评估。如果有合适的放射性示踪剂，使用核磁共振成像（例如MRI、PET和单光子发射计算机断层扫描（SPECT））等非侵入性技术检查体内蛋白质和生化过程的定量是非常明智的医学策略。为了满足非侵入性定量PD-L1水平的需求，一系列成像试剂，包括mAb，mAb片段，小分子蛋白和肽并在临床前模型中进行了早期研究，并显示出令人鼓舞的结果。大多数报道的研究都利用了已经开发的，现成的靶向PD-L1的mAb药物。通过对这些药物mAb赖氨酸残基的ε-氨基进行化学修饰连接金属螯合剂。然后将这些mAb偶联物与放射性半衰期长的放射性金属螯合（ 89Zr、111In、64Cu等）。
在早期的研究中，大多数是在具有人类肿瘤异种移植物的免疫受损小鼠或具有同基因肿瘤的免疫功能小鼠中进行的。这些观察结果表明使用PET可以获得评估在免疫启动中起重要作用的组织中PD-L1水平变化的机会。因为mAb片段分子量小，利于组织渗透，合成更方便，可实现更快的药代动力学效应等优点，研究者们目前更倾向于选择小分子量的mAb片段或肽片段作为成像剂。比如，研究者们筛选出了一种与PD-L1有着高亲和力的（<10 nM）的肽片段-WL12，并开发出了64Cu标记的DOTAGA共轭肽-[64Cu] WL12（见图1A、B）。同对照组相比（CHO和SUM149），[64Cu] WL12在稳定表达PD-L1的中国仓鼠卵巢细胞系中（hPD-L1）及具有高PD-L1表达的TNBCMDAMB231细胞系种表现出体外和体内特异性（图1C，D）。重要的是，由[64Cu] WL12-PET提供的高特异性和高对比度图像还能够量化肿瘤中PD-L1水平的动态变化，从而表明有可能定量分析治疗诱导的PD-L1水平的变化。▼ 图1：WL12结构及与PD-1的相互作用
（A）WL12及其类似物的结构；（B）WL12与PD-L1的结合模式预测。WL12在PD-L1的凹槽中形成β片状结构。WL12以青色显示。PD-L1的表面表示为灰色，缎带和关键侧链的显示为红色；WL12模仿PD-1与PD-L1的结合。PD-1的结构以蓝绿色显示。PD-1的两个主要相互作用的β链与WL12结合到PD-L1的构象有重叠。（C）对具有hPD-L1（红色箭头）和CHO肿瘤（蓝色箭头）的NSG小鼠静脉内给予150 µCi的注射放射性示踪剂后第10、60和120分钟获取[64Cu] WL12图像。3D体积渲染图像显示[64Cu] WL12在hPD-L1肿瘤中的特异性积累。（D）PD-L1 IHC证实在hPD-L1肿瘤有出很强的免疫反应性（棕色）。
三项研究报道了在人体中首次使用放射性核素（89Zr，18F和99mTc）标记的三种不同分子抗体蛋白（mAb，adnectin和sdAb）对肿瘤PD-L1水平进行定量。发现所有这三种药物都是安全有效的，观察到不同患者之间，或是同一患者不同部位的肿瘤，如转移和继发性淋巴器官，对于抗体的摄取情况是有差异的。由于新陈代谢的特点不同和蛋白清除率差异，放射性示踪剂在其他组织中的分布也有所不同。在不同癌症类型之间也观察到摄取差异。[89Zr] atezolizumab在膀胱癌、NSCLC及TNBC患者中的摄取与靶病灶负荷变化有关，并且在表现出更好疗效反应的患者中摄取量更高（图2）。在少数患者中，不是基于PD-L1 IHC或基于RNA序列的生物标志物的预测，而是[89Zr]atezolizumab的基线标准摄取值（SUVmax）指示了患者有较好的结局。在淋巴结和脾脏中观察到较高的[89Zr] atezolizumab摄取，反映了PD-L1的生理表达。[89Zr]atezolizumab在炎症部位的摄取量很高还指出，可能存在假阳性，并且有必要将影像学与IHC进行关联分析。[89Zr] atezolizumab在肝、肠和肾中的摄取很高，可能反映了mAb的代谢和清除机制。▼ 图2：[89Zr] atezolizumab 人体PET/C成像及SUVmax
（a）注射后第7天PET/CT图像在五个不同位置摄取了[89Zr]atezolizumab肿瘤（白色箭头表示肿瘤病变；每个患者和每个时间点进行一次PET扫描）。图像（i）和（ii）来自同一位患者，而图像（iii），（iv）和（v）来自另一位患者。
（b）注射后第7天对196个直径> 2 cm的肿瘤病灶[89Zr] atezolizumab基线标准摄取值SUVmax分析，按每种肿瘤类型分组，并通过增加每名患者的SUVmax几何平均数，可视化肿瘤的大小和部位以及血液中的摄取值作为背景参考。横杠表示每位患者的SUVmax几何平均值。（c）每个肿瘤类型病变中SUVmax的小提琴图（9名膀胱癌患者 N= 85，9名NSCLC患者中的 n= 43，4名三阴性乳腺癌患者中的 n= 68）。其中SUVmax值的从低到高百分位分析（1%，50%、99% SUVmax百分位值）：膀胱癌为3.6、10.9、38.0;非小细胞肺癌为1.7、9.7、19.6; TNBC为3.4、5.6、11.7）；黑色垂直线是SUVmax几何平均值的95％CI。黑线内的点和小提琴图下方的值是实际的几何平均值，均基于线性混合回归模型，该模型具有两侧Wald p值，并在有限最大可能性下使用Satterthwaite逼近自由度。（d）每个病变部位病变中SUVmax实际分布的小提琴图（ 10例肺部病灶患者中n = 44，9例骨病灶患者n = 62，20例淋巴结病灶患者n= 54，1例肝部病灶患者n= 19）。其中SUVmax值的从低到高百分位分析（1%，50%、99% SUVmax百分位值）：肺位1.7、7.9、19.6;骨骼为3.9、5.6、16.4；淋巴结分别为4.6、9.7、40.1；肝脏分别为16.1、23.3、34.1）；黑色垂直线是SUVmax几何平均值的95％CI。黑色内的白点小提琴图下方的线和值是实际的几何平均值，均基于线性混合回归模型，该模型具有两侧Wald p值，并在有限最大可能性下使用Satterthwaite近似自由度。另一种PD-L1成像剂18F-BMS-986192的研究也显示出在NSCLC不同患者中摄取量是不同的，TPS> 50％的患者的中位摄取（SUVpeak）高于<50％TPS的患者。与其他临床前和临床研究相似，在脾脏和淋巴组织中也观察到18F-BMS-986192的摄取。另外，由于分解代谢在肝脏中以及在肾脏和胃肠道中由于肾脏和胆汁清除而观察到非特异性摄取现象。值得注意的是，18F-BMS-986192的由于体积较小，也有助于在快速（60-90分钟内）获取图像。
▼ 图3 18F-BMS-986192肿瘤患者PET成像
患者2的PD-L1表达> 95％的肿瘤（左图）。18F-BMS-986192 PET（145.7 MBq，注射后1小时成像时间点（p.i.））证实了肿瘤内部和肿瘤之间的异质示踪剂摄取。肿瘤PD-L1表达<1％的患者3（右图），18F-BMS-986192 PET（214.62 MBq，1 h p.i.）显示出较低的肿瘤示踪剂摄取。用18F-BMS-986192 PET观察到脾脏和肝脏非特异性摄取为PD-L1生理表达。图像中的红色和蓝色分别表示最大和最小累积放射性（来自[156]）。
PD-L1 PET用于非侵入式定量动力学及药物开发
除了检测恶性肿瘤和正常组织中PD-L1的表达外，还研究了基于mAb的PD-L1 PET来检测化学疗法和放射疗法诱导的PD-L1动力学。在人类肿瘤异种移植物模型中，更高的89Zr放射性单抗摄取量，反映了紫杉醇可能诱导的PD-L1表达。放射疗法可诱导TME中PD-L1的表达，这主要是由于免疫细胞对辐射诱发的炎症反应的积累增加所致。但是，并不是在每个肿瘤中都观察到PD-L1表达的增强。MEK抑制剂治疗可导致肿瘤中PD-L1表达的下调，这有可能使用PET进行量化。[18F] BMS-986192的研究表明显像剂摄取量显着降低反映了用MEK抑制剂selumetinib治疗24小时后PD-L1水平下调了50％[158]。此外，使用89Zr-Df-KN035（一种源自纳米抗体的放射性示踪剂）定量了EGFR抑制剂诱导的PD-L1下调的变化。这些临床前观察结果有可能在临床环境中得到验证，因为所使用的治疗方法已获批准或正在接受临床研究。迄今为止，所有批准的PD-1/PD-L1药物均为单克隆抗体药物。与小分子药物不同，PD-L1 mAb与靶标的相互作用通常会影响药物的PK，即PD-L1 mAb的功效关键取决于其目标参与程度。另外其他调节剂，伴随治疗或疾病进展对PD-L1的调节可导致PK改变，进而导致mAb的PD效应。数千种联合疗法正在进一步研究中，这难以确定肿瘤处的药物浓度并评估其与治疗结果的相关性。而用于体内药物靶点参与实时评估的技术太少。在分子建模研究中，研究人员观察到PD-L1上的WL12相互作用表面与PD-L1上的PD-1和PD-L1 mAb相互作用表面有重叠（图1B），并且WL12与抗PD-L1 mAb相比（>2 nM vs. <2 nM）亲和力低。研究者们设想是否可以将放射性标记的肽片段的PET用于定量分析mAb治疗期间与PD-L1的结合水平。这样的定量测量可以告知任何单克隆抗体在肿瘤上的靶标结合潜力。为了对此进行测试，研究者将几种表达PD-L1的癌细胞系与抗PD-L1 mAb和[64Cu] WL12一起孵育。结合的放射性测量结果显示，在细胞中结合的[64Cu]WL12明显更少（图4）。
图4.用[64Cu] WL12定量的3种不同的治疗性抗体与肿瘤PD-L1的结合
在24小时前接受（A）生理盐水，（B）AtzMab（20 mg / kg），（C）AveMab（10 mg / kg）或（D）DurMab（10 mg / kg）的小鼠中，MDA-MB-231异种移植物中[64Cu] WL12的摄取显着降低。（E）（n = 6-9 /组）。（F）在相应的肿瘤中PD-L1的IHC染色，比例尺：100 µm。箱形图显示了最小到最大以及所有数据点，水平线表示中位数。**** p<0.0001; NS（不显着）
然后，研究者们测试了这些观察结果是否可以在人体内重现。在NSCLC和TNBC患者中，用饱和剂量的所有PD-L1 mAb（atezolizumab、avelumab和durvalumab），与盐水处理对照组相比，均观察到[64Cu]WL12摄取显着降低。这些研究为确定mAb剂量及弄清肿瘤中靶标结合的作用奠定了基础。这样的检测方法具有指导未来药物剂量和优化的潜力，并且对于鉴定新型mAb治疗剂（如双特异性mAb）的剂量可能至关重要。最近对于PD-L1成像剂进行的首次人体评估试验引入了一种无创定量的方法，可以指导和评估ICT治疗的效果。但该方法仍然有许多挑战存在，诸如对PET数据的解释和整合问题仍需要解决。很显然，目前还没有一种适合所有患者的生物标志物检测方法用于监控免疫疗法的效果。因此，包含多种生物标志物（包括成像数据）的联合应用将具有很高的价值。此类新颖方法为及时制定治疗计划以实现癌症患者的长期持久获益提供了机会。
参考文献
1. SridharNimmagadda.Quantifying PD-L1 Expression to Monitor Immune Checkpoint Therapy:Opportunities and Challenges.Cancers 2020, 12(11), 3173.
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