本期《学术先声》栏目分享一篇由同济大学附属东方医院吴文娟教授团队和香港中文大学微生物学系及先声诊断科研和感染研发团队，在Frontiers in Microbiology （IF=6.064）发表的最新研究成果 [1]。该研究利用全基因组测序和多位点序列分型技术，报道了中国华东地区HIV阳性和阴性感染的新型隐球菌分子流行病学和耐药特征。

研究背景

隐球菌病（cryptococcosis）是常见的侵袭性真菌病之一，全球每年新发病例约223000例，死亡人数约达181100人。隐球菌常感染是免疫功能缺陷人群，具有高致死率和高发病率，偶发于免疫正常人群。新型隐球菌（Cryptococcus neoformans，C. neoformans）和格特隐球菌（Cryptococcus gattii，C. gattii），也统称为新型/格特隐球菌复合体（Cryptococcus gattii/neoformans species complexes），是引起隐球菌病的两大致病菌。

在过去的20年，基于基因型和表型特征的系统进化树分析，已经发现2种C. neoformans亚型和5种C. gattii亚型。C.neoformans的2种亚型分别是新型隐球菌格鲁比变种（C. neoformans var. grubii）和新型隐球菌新生变种（C. neoformans var. neoformans）。其中前者的分子型为VNI（AFLP1）、VNII（AFLP1A/IB）和VNIII（AFLP3），后者为VNIV（AFLP2）。

在欧美及非洲等国家，新型隐球菌主要感染HIV阳性人群，然而在中国，新型隐球菌主要感染HIV阴性患者。

针对隐球菌病，美国传染病学会（The Infectious Diseases Society of America，IDSA）推荐诱导治疗使用两性霉素B （amphotericin B）联合5-氟胞嘧啶（5-fluorocytosine），巩固治疗使用氟康唑（fluconazole）。根据中国侵袭性真菌耐药监测网发布的数据，隐球菌病对氟康唑的耐药率已经从2010年的10.5%上升至2014年的34%；中国的另一个多中心研究数据显示，C.neoformans对氟康唑的耐药率大大增加，并且已发现对耐5-氟胞嘧啶的非野生型菌株。

研究目的

在中国华东地区HIV阳性和阴性患者中，从基因组学层面分析新型隐球菌格鲁比变种的流行病学特征及耐药机制。

研究结果

1. 抗真菌药物敏感性试验

研究人员对收集的所有新型隐球菌进行4种不同药物的药敏实验。结果显示，93.98到100%的新型隐球菌对氟康唑、5-氟胞嘧啶和伏立康唑都具有较高的药物敏感性。然而，89.15%的新型隐球菌（109/133）是对两性霉菌B耐药的非野生型菌株，另外有8株对氟康唑耐药，以及8株属于耐5-氟胞嘧啶的非野生型株。与2018年CLSI M59推荐的MIC值比较后发现，存在对5-氟胞嘧啶和氟康唑更高MIC值的菌株，分别达64μg/ml和32μg/ml。有趣的是，本研究发现了三株多重耐药株，1株来自HIV阳性患者，其余2株来自HIV阴性患者（表1）。

表1. HIV阳性和HIV阴性患者来源的新型隐球菌体外药敏实验结果汇总  

接着，研究人员分别比较HIV阳性和HIV阴性组中氟康唑和5-氟胞嘧啶的MIC值分布，结果显示，氟康唑在两组的MIC值分布是相似的（p=0.29），5-氟胞嘧啶的MIC值在阴性组高于阳性组，且p值小于0.001（图1）。

图1. 在HIV阳性和HIV阴性组中氟康唑和5-氟胞嘧啶的MIC值分布特征

2. ST型与HIV的相关性

利用MALDI-TOF MS和IGS1测序对133株临床新型隐球菌进行鉴定，130株鉴定为新型隐球菌格鲁比变种（C. neoformans var. grubii），3株鉴定为新型隐球菌新生变种（C. neoformans var. neoformans）。在3株新型隐球菌新生变种中，有2株来自HIV阳性组，ST型为ST77和ST93，另外1株来自HIV阳性组，为ST185。经MLST鉴定后，所有新型隐球菌可分成9种STs，主要的新型隐球菌是新型隐球菌格鲁比变种ST5（VNI，90.23%，120/133）。对两组各类型STs比例进行统计，在HIV阳性组，ST5占86.88%（53/61）、ST43占1.64%、ST63占1.64%、ST77占1.64%、ST93占1.64%以及ST230占1.64%。在HIV阴性组，总共有四种STs，包括ST5（93.05%，67/72）、ST31（1.39%）、ST185（1.39%）和ST653（2.78%）。HIV阳性组比HIV阴性组具有更多的ST多样性。此外，未发现STs与是否感染HIV存在显著相关性（p =0.256）。总而言之，新型隐球菌格鲁比变种ST5型是中国华东地区最具代表性和优势性的隐球菌亚型。

3. 多重耐药的新型隐球菌的基因组特征

本研究利用全基因组测序对三株多重耐药株进行了分析。这些耐药株交配型均属于MAT α。来自HIV阳性组的耐药株YQJ185 1号染色体发生大片段拷贝数变异（图2A），且ERG11基因的血红素结合的保守结构域上存在G484S突变。然而，来自HIV阴性组的其他两株耐药株均没有发生拷贝数变异（CNV）和ERG11基因非同义突变。此外，三株耐药菌株在FUR1基因的不同位点均发生非同义突变。在HIV阳性组，YQJ185的FUR1基因发生D42Y突变。在HIV阴性组，YQJ68的FUR1基因发生P140S突变，YQJ247的FUR1基因剪接位点出现A到T的突变（图2 B）。

图2. 3株耐药株的遗传特征

（A）耐药株YQJ185的核型分析。以拷贝数为1作为基线。x轴是每条染色体的read位置。（B）发生在ERG11和FUR1基因的非同义突变和剪切位点突变。

进一步对这些耐药株的核心SNP进化树分析发现新型隐球菌ST5属于VNIa型菌株的亚分支，是中国主要的新型隐球菌亚型。HIV阴性组来源的两株耐药株与1998年从中国一名HIV阴性患者分离的CHC-193菌株同属一个亚支（图3）。

图3. 全球ST5新型隐球菌的核心SNP进化树

选择新型隐球菌H99基因组作为参考和系统发育树的根，系统进化树的构建基于44487个SNP位点，红色分支表示这些分离株源自中国。

结论

本研究利用MALDI-TOF MS和IGS1测序，对来自中国华东地区HIV阳性或阴性患者的133例新型隐球菌株进行了物种水平的鉴定。大部分的菌株为新型隐球菌变种格鲁比（C. neoformans var. grubii），占比高达97.74%（130/133），其余为新型隐球菌新生变种（C. neoformans var. neoformans），仅占2.06%（3/133）。进一步使用MLST技术进行ST分型，共鉴定到9种STs，其中ST5占比最大（90.23%，120/133）。ST分型与HIV分组不存在相关性。

药敏试验显示，本研究纳入的新型隐球菌均对伏立康唑敏感，对两性霉菌B耐药的非野生型株超过一半，占比高达89.15%（109/133）。此外，共发现8株对氟康唑耐药的新型隐球菌株，以及8株对5-氟胞嘧啶耐药的非野生型菌株。

本研究发现了3株多重耐药的新型隐球菌，并完成了全基因组测序。测序结果显示，这些多重耐药株中存在一些独特的基因组变异，例如，在一株对5-氟胞嘧啶的新型隐球菌中，FUR1基因存在一种未报道的突变；在另一株对氟康唑具有高水平耐药（MIC值为32 μg/ml的新型隐球菌株，检测到1号染色体大片段拷贝数变异及ERG11基因G4845突变。

参考文献：

[1]   Zhou Z, Zhu C, Ip M, Liu M, Zhu Z, Liu R, et al. Molecular Epidemiology and Antifungal Resistance of Cryptococcus neoformansFrom Human Immunodeficiency Virus-Negative and Human Immunodeficiency Virus-Positive Patients in Eastern China. Front Microbiol 2022;13:942940. https://doi.org/10.3389/fmicb.2022.942940.    

本文来源：上海市东方医院检验科

撰写丨xiaosine  

编辑、排版丨SX

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