小细胞肺癌（SCLC）占肺癌总数的 10-15%，具有进展快和早期转移扩散快速、预后差等特点。大多数 SCLC 患者诊断时即为广泛期（ES-SCLC）转移性阶段（IV 期），仅仅约三分之一被诊断为局限期疾病（LS-SCLC，IA-IIIB 期）。此外，当前传统的化疗与免疫疗法效果并不理想，由于疾病进展导致获得性耐药的原因，很少有患者存活超过 1-2 年。因此，探索 SCLC 新的早期生物标志物用于区分患者分层和指导治疗策略对于提高患者生存至关重要。基于血液中循环 DNA（cfDNA）的液体活检方式被证明具有肿瘤诊断的临床优势，其中 DNA 甲基化被认为是 SCLC 生物学中重要的调节因子。因此对于 SCLC 进行 cfDNA 甲基化分析可以检测肿瘤基因组改变，以及揭示不同亚组分型的表观遗传特征，但当前仍缺乏相关方面的探索研究。

近日，由英国曼彻斯特大学癌症研究所研究团队在著名期刊 Nature Cancer 发表题为 “cfDNA methylome profiling for detection and subtyping of small cell lung cancers” 的文章。研究者利用全基因组 cfDNA 甲基化分析从而创建了一种非侵入性、敏感且普遍适用检测方法，用于 SCLC 的全期诊断和分子分型，为肿瘤早期诊断、分子分型和疾病监测提供了重要的参考。

Doi：10.1038/s43018-022-00415-9

 方法 

研究者开发了一种新型 cfDNA 甲基谱二代测序方法（T7-MBD-seq），该方法不需要亚硫酸氢盐处理，从 110 份样本中（包括 97 份来自 SCLC 患者的异种移植物（PDX）或循环肿瘤细胞外植体（CDX）样本，以及 13 份健康肺组织样本）进行模型的检测评估（流程图见图 1a 所示）。

 主要研究结果 

01   cfDNA 甲基化模式的检测

通过对 SCLC 模型和对照组样本进行差异甲基化区域（DMR）的主成分分析（PCA），相比于对照样本，SCLC 样本呈现出更多可变的 DNA 甲基化模式，表明潜在的表观遗传异质性特征。且 DMR 在肿瘤中呈现高甲基化富集（69%）。通过分析 PDX/CDX 样本和健康样本的甲基化谱，结果显示：T7-MBD-seq 具有区分 SCLC 模型和健康对照组之间显著的 DMR 能力（图 1c 所示）。接下来，研究者通过 T7-MBD-seq 评估了 157 个 cfDNA 样本甲基化特征，包括 78 个 SCLC 患者（29 个 LS-SCLC 和 49 个 ES-SCLC）和 79 个非 SCLC 患者（NCCs）。结果显示：cfDNA 甲基化样本富集分数和组织样本相当（图 1d 所示），且 DMR 的 PCA 分析显示能够将大部分 SCLC、NCC 样本分离，分离水平取决于肿瘤分数。此外，研究发现在所有情况下，cfDNA 和组织甲基化谱呈现高度一致性（图 1e 所示）。上述结果表明：T7-MBD-seq 方法在组织中提供了可重复的和特征性的 SCLC 甲基化谱，且在 cfDNA 中也容易检测到 SCLC 甲基化谱。

图 1：CDX/PDX 模型和 cfDNA 样本中 SCLC 甲基化检测的工作流程

02   cfDNA 甲基化模型用于 SCLC 的早期诊断

为构建基于血液 DNA 甲基化检测的 SCLC 诊断模型，研究者通过机器学习方法和此前识别的 4061 个 DMR，通过重复训练过程 100 次，每次使用 80% 的样本，敏感度和特异度分析来确定最佳截止值，用于 DNA 甲基化诊断模型的构成（构建流程见图 2 所示）。然后，将经过训练的分类器应用于 119 个 cfDNA 样本的验证集，包括 NCC（n = 41）、LS-SCLC（n = 29）和 ES-SCLC（n = 49）患者。模型分别正确分配了 93% 和 100% 的 LS-SCLC 和 ES-SCLC 患者，预测评分与疾病分期具有显著相关性（Kendall 等级相关系数：0.52，P=0.0041）。模型对于 LS-SCLC 和 ES-SCLC 的预测性能分别为：曲线下面积 AUC= 0.986 和 1。

上述结果表明：基于 cfDNA 甲基化的诊断模型显着提高了 SCLC 检测性能和灵敏度，即便对于早期、肿瘤负荷低的患者同样表现稳健（图 3 所示）。

图 2：创建敏感肿瘤检测的 DNA 甲基化分类器

图 3：基于 SCLC cfDNA 甲基化模型的诊断性能

03   cfDNA 甲基化评分评估 SCLC 的预后

最后，研究者继续通过甲基化评分模型评估 SCLC 患者的预后的预测效能。根据分类器使用的基因组区域中检测到的平均甲基化水平得出每个 cfDNA 样本的 SCLC 甲基化评分以评估患者的总生存（OS）情况。结果表明：甲基化评分与分期（P<0.0001）和 ichorCNA 肿瘤分数（皮尔逊相关系数：R=0.84，P<0.0001）呈正相关，与平均 DNA 片段大小呈负相关（皮尔逊相关系数：R=-0.37，P= 0.00082）。此外通过 Kaplan–Meier 生存曲线得知：甲基化低评分组患者的 OS 显著高于高评分组患者（中位 OS：20.6 vs. 8.5m，P = 0.00015）。通过多变量 Cox 回归分析，连续或二分类变量的甲基化评分模型与 OS 显著相关（HR：3.60）（图 4 所示）。此外，相比较于包含年龄、性别和疾病分期的传统模型，增加甲基化评分的模型具有较低的Akaike信息标准和贝叶斯信息标准值和较高的一致性指数值。上述结果证明：cfDNA 甲基化分析在 SCLC 中具有潜在的临床效能，其对 SCLC 患者的生存预后进行准确的评估。

图 4：甲基化评分可预测 SCLC 患者的生存预后

总结 

该研究通过构建一种非侵入性、灵敏且普遍适用的基于血液 cfDNA 甲基化检测方法，对 SCLC 疾病早期诊断、疾病生存监测以及分子分型的评估具有潜在的临床效用。

包括以上基于血液 cfDNA 甲基化的检测方法在内，当前，通过表观遗传修饰用于早期肺癌的筛查以及肺结节良恶性定性诊断的研究愈发成熟，联合其他多组学的方式，对于肿瘤的早筛早诊、治疗选择以及预后评估为临床诊疗的开展也会有重大的意义。多组学作为一种全新的生物学分析方法，给临床诊疗提供了更多有效参考。

基于独家多组学技术成果，泰莱生物与同济大学附属上海市肺科医院共同牵头发起了 MISSION 计划（全称：Multi-omIcs claSSIfier for pulmOnary Nodules，即基于多组学的肺结节良恶性鉴别诊断前瞻性多中心临床研究），四川大学华西医院、山东省胸科医院等数十所三甲医院联合参与，旨在利用基于影像组学、表观基因组学、代谢组学、临床表型组学等多组学技术，针对医学影像显示肺结节的患者进行肺结节良恶性鉴别诊断，以推进早期肺癌的诊断效率并帮助肺癌患者更早实施临床诊疗，从而提升患者生存率。MISSION 计划拥有目前我国该领域内最大（获得病理诊断结果）规模的临床研究队列，经过分析万例临床肺结节患者胸部 CT、血液中代谢物质及 cfDNA 羟甲基化水平数据，构建出了肺结节诊断多组学融合模型，并以此转化了斐盼安®（影像组学 + 代谢组学）、斐盼康®（影像组学 + 代谢组学 + 表观基因组学）两款产品，可对肺结节良恶性鉴别提供高效、可靠的参照，将对优化与完善早期肺癌临床诊疗起到重要的辅助作用。

肺癌是我国发病率和死亡率双冠的恶性肿瘤，肺结节作为早期肺癌最主要、最常见的表现形式，早期发现并识别恶性肺结节患者也是降低肺癌死亡风险的重要预防措施。借助科学的检测方式，尽早地明确自身健康风险，癌症“早知道”，健康更可得。

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