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去糖基化的PD-L1蛋白可能成为癌症免疫治疗更可靠的生物标志物

NO.2

2021-10-20 来源 : VIP说

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随着PD-1/PD-L1抑制剂接连获批多个适应症，充分的了解免疫治疗的机制和筛选获益人群已经成为了当今的研究热点，今天我们就来聊一聊PD-L1蛋白糖基化的那些事儿。

众所周知，糖基化是真核生物中膜结合蛋白最丰富的翻译后修饰之一，并影响着许多生物学活性。其中包括蛋白的生物合成，蛋白稳定性，细胞内运输，亚细胞定位和配体-受体相互作用等。

越来越多的证据表明，在人类癌症中细胞膜免疫检查点蛋白，例如程序性死亡配体蛋白1（PD-L1）有很多的N-糖基化。PD-L1蛋白的N-糖基化可以保持其稳定性以及与其受体程序性细胞死亡蛋白1（PD-1）的相互作用，进而逃避T细胞的免疫作用。

另一方面，在临床检测中发现糖基化的PD-L1蛋白阻碍了诊断抗体的识别。通过去糖基化可以更准确的预测PD-1/PD-L1抑制剂的治疗效果。

对PD-L1蛋白糖基化详细的了解可以为免疫检查点抑制剂用于癌症治疗的临床发展提供新思路，并加深我们对生物标志物的认识，从而筛选出更合适的受益患者。

今年发表在JOURNALOF BIOMEDICAL SCIENCE（IF：5.762）的一篇综述中，对PD-L1蛋白的糖基化进行了重点介绍。

此外，还探讨了去糖基化PD-L1蛋白作为预测生物标志物来指导抗PD-1/PD-L1免疫治疗的概念。

引言

糖基化是将糖缀合物添加到目标分子中的酶促过程，该目标分子通常是蛋白质和脂质。糖基化的主要作用是通过影响蛋白质的结构以及与其它分子的相互作用来调节蛋白质的生物合成，折叠和稳定性，是一种膜结合蛋白在结构上最多样化的翻译后修饰。

由于糖基化的改变可引起持续的增殖性信号传导，细胞与细胞的相互作用，血管生成，侵袭和转移以及免疫抑制等。因此，糖基化已逐渐在癌症研究中引起重视。

多聚糖的异常变化已经被证明可作为非入侵性肿瘤生物标志物，例如胰腺癌中的癌胚抗原（CA-199）和肝细胞癌中的甲胎蛋白（AFP）。

糖缀合物的类别主要包括N-连接和O-连接的糖蛋白，其可携带包括一种或多种的聚糖类型。主要通过天冬酰胺（Asn）的氮原子（N）或丝氨酸（Ser），苏氨酸（Thr）的氧原子（O）共价连接于多肽骨架上，因此被命名为N-糖基化或O-糖基化。

哺乳动物中具有N-糖基化的蛋白通常与膜结合或是被分泌出来，其中就包括我们所熟知的免疫检查点。

近年来，阻断PD-1/PD-L1抑制途径的肿瘤免疫疗法，已经被充分证明可以使T细胞的免疫功能得以重新激活，从而为各种类型的癌症患者带来显著的生存获益。

但是，单独PD-1/PD-L1抑制剂治疗的缓解率往往不高。此外，在患者组织中检测到的PD-L1水平并不能很好的预测疗效。

因此，很好的了解翻译后修饰（如N-糖基化）及其在癌症治疗和临床诊断中的意义，可以让我们对PD-L1蛋白的表达和调控的有一个更清晰的认知。

PD-L1蛋白N-糖基化对癌症治疗的影响

PD-L1蛋白的N-糖基化存在于多种肿瘤类型中，其中包括黑色素瘤，乳腺癌，肺癌和结肠癌。通过Western-blot结果显示，糖基化后的PD-L1蛋白大概在50kDa的条带范围，而非糖基化的PD-L1蛋白大约在33kDa处。

通过深入的分析确定了PD-L1蛋白共有4个谷氨酰胺（Asn）残基可进行糖基化。当将这四个谷氨酰胺突变为谷氨酰胺时，PD-L1蛋白的糖基化将会完全消失。

目前，有越来越多的证据表明PD-L1蛋白的糖基化在PD-1/PD-L1抑制剂介导的肿瘤免疫治疗中有着重要的影响。例如在一项动物试验中，表达野生型PD-L1蛋白的小鼠乳腺肿瘤细胞的生长速度要远远快于PD-L1蛋白糖基化突变型的小鼠。

但在严重的免疫缺陷型（SCID）小鼠中却没有观察到显著的差异，这说明PD-L1蛋白的糖基化对体内的免疫抑制功能有着很重要的影响。此外，另一项研究表明一种饮食中的多酚化合物白藜芦醇可通过促进PD-L1蛋白的异常糖基化和二聚作用来增强体外抗肿瘤的免疫能力。

总之，众多研究都有发现PD-L1蛋白的糖基化有着免疫抑制和促进肿瘤生长的作用。因此，了解PD-L1蛋白糖基化的调控机制和细胞功能可能会开发出针对PD-L1糖基化潜在的有效疗法，以用于临床治疗中。

PD-L1蛋白N-糖基化对蛋白稳定性的影响

相关研究发现糖基化的PD-L1蛋白的转化率要比非糖基化的PD-L1蛋白慢，这说明PD-L1的糖基化增强了稳定性。PD-L1蛋白上的N192，N200和N219位点的糖基化可以阻止GSK3β介导的26S蛋白酶降解作用，进而起到稳定PD-L1蛋白的作用。

研究进一步发现，EGF/EGFR信号通路可以导致GSK3β失活，从而诱导PD-L1蛋白的糖基化和稳定。而在药理学上阻止该过程可以破坏PD-L1的稳定性，并增强PD-1抑制剂在三阴性乳腺癌（TNBC）和结肠癌小鼠模型中的功效。

一项后续研究表明，EGF/ EGFR信号通路可以通过β-1,3-N-乙酰氨基葡萄糖氨基转移酶（B3GNT3）增强PD-L1糖基化，从而导致PD-L1与其同源受体PD-1的结合。在对胶质母细胞瘤的细胞实验中发现，FKBP51s一种糖皮质激素受体的亚型，可以催化内质网中PD-L1蛋白的糖基化进而增强PD-L1蛋白的稳定性。

通过抑制FKBP51s的催化活性可以显著降低PD-L1的表达水平。最近一项研究表明，上皮-间质转化（EMT）过程可诱导N-糖基化转移酶STT3的活性，并促进PD-L1蛋白N-糖基化以稳定和富集癌症中干细胞的PD-L1表达，从而导致免疫逃逸。

在乳腺癌和结肠癌的小鼠模型中显示依托泊苷的治疗可以逆转上皮-间质转化（EMT）作用进而下调PD-L1的表达，并增强T细胞免疫球蛋白黏蛋白3（Time-3）免疫检查点抑制剂治疗的敏感性。

随后的两项研究进一步表明，PD-L1蛋白的磷酸化与糖基化和稳定性有关。在其中的一项研究中，作者揭示了二甲双胍可以诱导AMP活化蛋白激酶催化PD-L1蛋白第195处色氨酸的磷酸化，这会导致PD-L1的糖基化异常，最终使得其在内质网中累积而被降解。二甲双胍对PD-L1表达下调的作用，已经在黑色素瘤，乳腺癌和结肠癌的小鼠模型中被发现，并将其与CTLA-4抑制剂联用可产生潜在的治疗效果。

在另一项研究中发现，IL-6激活的JAK1途径可以将PD-L1蛋白的第112位的酪氨酸磷酸化，从而可招募N-糖基转移酶STT3A来催化PD-L1蛋白的糖基化，进而维持PD-L1蛋白的稳定性。通过加入抗IL-6抗体，可以下调PD-L1的表达，使得肝细胞癌细胞对Tim-3免疫检查点抑制剂治疗敏感。

总而言之，上述研究的发现均说明了PD-L1蛋白糖基化在稳定PD-L1蛋白表达和促进免疫逃逸中的关键作用，并建议将抑制PD-L1蛋白糖基化作为癌症免疫治疗的靶点，在抑制PD-L1蛋白糖基化的同时与其它的免疫疗法联用可以达到更好的抗肿瘤效果。

PD-L1蛋白N-糖基化与PD-1蛋白相互作用

N-糖基化除了稳定PD-L1蛋白以外，在一项研究中显示EGF/EGFR通路诱导的PD-L1蛋白的N-糖基化，在与PD-1蛋白的物理接触中是必需的。

在一项三阴性乳腺癌研究中发现，EGF/EGFR通路可以上调N-葡萄糖转移酶（B3GNT3）的表达，该酶催化了PD-1/PD-L1相互作用时PD-L1蛋白所需的N192和N200上的聚N-乙酰基乳糖胺的合成。

通过加入N-糖基化抑制剂发现可以有效的减少PD-L1/PD-1的结合，说明这种相互作用会受到N-糖基化的调节作用。与上述观察的结果保持一致，在具有免疫原性的小鼠模型中，敲除了B2GNT3基因的4T1细胞比未敲除的对照组的细胞生长明显缓慢，但这种现象在免疫缺陷的SCID小鼠模型中并没有发现。

进一步说明肿瘤生长变慢的原因可能是PD-L1蛋白N-糖基化影响的PD-L1/PD-1相互作用所导致的。这些发现表明，如果直接靶向N-糖基化的PD-L1蛋白可能会有效的改善临床治疗效果。

由此可见，PD-L1蛋白的糖基化除了可以阻止蛋白酶的降解来维持自身的稳定性，还可以增强其与PD-1蛋白结合，最终导致T细胞免疫抑制的作用。因此，在临床实践中，开发针对糖基化的PD-L1蛋白靶点药物，并与其它疗法进行组合，可能可以实现最大的生存获益。

PD-L1蛋白N-糖基化对PD-L1检测的干扰

如前所述，PD-L1是具有N-糖基化的细胞膜蛋白，这些N-糖基化（17kDa）约占PD-L1多肽（33kDa）的52%。最近，有研究表明，PD-L1蛋白的多聚糖基化会阻碍PD-L1蛋白的检测，这些区域导致其难与检测抗体进行结合，这可能会使得某些患者组织中的PD-L1阳性率不准确，从而引起了治疗结果的不一致性。

另外一个方面，目前市面上大多数可购买获得的抗体，通常是由细菌或其它宿主生物中表达的合成肽或重组蛋白抗原，这些蛋白质一般不具有翻译后修饰，如糖基化。

在这种情况下，通过将未糖基化的PD-L1抗原暴露于PD-L1检测的抗体中，消除PD-L1蛋白上糖基化的空间位阻影响，有可能改善PD-L1的检测，并且这种检测方式可以更准确地预测PD-1/PD-L1抑制剂治疗的疗效。

Lee等人在一项研究中，研发了一种崭新的检测PD-L1蛋白的方法。使用糖苷内切酶分解去除细胞表面的糖基化修饰，使得PD-L1蛋白不受糖基化结构的遮蔽，而易于被PD-L1抗体别。该过程被称为样本的去糖基化。

首先研究者在细胞试验中通过重组糖苷酶消化处理，去除了整个N-连接的糖基化。随后在共聚焦免疫荧光显微镜和ELISA实验中发现与未进行处理的样本相比，经过重组糖苷酶处理后的PD-L1蛋白检测荧光强度有所增强。

随后，研究者进一步在肿瘤组织样本中进行验证，探索了去糖基化对检测PD-L1蛋白的影响。其中包括乳腺癌，肺癌，肠癌，前列腺癌和胰腺癌。

结果发现大多数样本的PD-L1蛋白在经过免疫组化检测的阳性率提高了2倍以上，说明PD-L1蛋白的N-糖基化严重降低了其对PD-L1抗体的识别。

总而言之，该研究表明在临床诊断中，PD-L1蛋白的N-糖基化阻止了PD-L1抗体对PD-L1蛋白的检测，通过对样品的去糖基化可以大幅度的提高PD-L1蛋白的检出率，从而最大程度的减少PD-L1的假阴性检测。

预测PD-1/PD-L1抑制剂的生物标志物

为了进一步了解PD-L1阳性率在临床响应率中的不一致性。在一项回顾性研究中探讨了PD-L1蛋白的去糖基化对PD-1/PD-L1抑制剂治疗的预测。

研究者对44例经过免疫检查点抑制剂治疗的肺癌患者的样本进行了去糖基化后的PD-L1蛋白检测，并进行Pearson相关性分析，结果发现去糖基化后的PD-L1蛋白的检测情况与患者的无进展生存期（PFS）的相关性得到了显著提高。

这说明去糖基化的PD-L1蛋白检测水平能够更好的预测PD-1/PD-L1抑制剂的疗效。

总的来说，组织样本中去糖基化后可以让IHC检测更加准确的评估PD-L1蛋白的表达水平，而去糖基化的PD-L1蛋白有可能成为更好的生物标志物来预测PD-1/PD-L1抑制剂的治疗效果。

结论

在本文中，我们探讨了N-糖基化对免疫检查点蛋白PD-L1在癌症治疗和临床诊断中的关键作用。PD-L1是具有高度N-糖基化的细胞膜蛋白分子，糖基化部分对于其免疫抑制作用非常重要，可以起到稳定PD-L1蛋白以及促进与PD-1蛋白相互接触的作用。

但是，PD-L1蛋白的N-糖基化在PD-L1蛋白的检测中却有着负面影响，使其很难与PD-L1诊断抗体进行结合，从而导致一些患者样本中的IHC结果不准确，使得临床治疗的结果发生矛盾的现象。

因此，提出了一种新的检测方法，以糖苷内切酶去除糖基化，进而增加PD-L1蛋白的检出率更准确的帮助筛选合适的患者接受免疫治疗。去糖基化的PD-L1蛋白有望成为指导癌症免疫治疗的更可靠的生物标志物。

参考文献

1. Ying-Nai Wang, Heng-Huan Lee, JenniferL. Hsu, et al. The impact of PD-L1 N-linked glycosylation on cancer therapy andclinical diagnosis, Journal of Biomedical Science,(2020) 27:77.

2. Heng-Huan Lee, Ying-Nai Wang, Weiya Xia,etal. Removal of N-Linked Glycosylation Enhances PD-L1 Detection and Predicts Anti-PD-1/PD-L1Therapeutic Efficacy, Cancer Cell, July 18, 2019.